固相及び溶液相の組み合わせ技術を使用したインシュリン分泌性ペプチド合成

专利摘要:
本発明は、固相及び溶液相（「ハイブリッド」）アプローチを使用して合成されるインシュリン分泌性ペプチドの調製に関する。一般的に、アプローチは、固相化学を使用して３つの異なるペプチド中間体フラグメントを合成することを含む。溶液相化学を次に使用して、追加のアミノ酸材料を第３のフラグメントに加えて、それを次に第２のフラグメントに、そして次に第１のフラグメントに溶液中で結合させる。あるいは、異なる第２のフラグメントを、第１のフラグメントに固相中で結合させる。次に、溶液相化学を次に使用して、追加のアミノ酸材料を異なる第３のフラグメントに加える。後に、この異なる第３のフラグメントを、結合した第１の及び異なる第２のフラグメントに溶液相中で結合させる。フラグメントの１つにおける疑似プロリンの使用によって、そのフラグメントの固相合成が容易になり、また、このフラグメントの他のフラグメントへの後の溶液相結合が容易になる。本発明は、インシュリン分泌性ペプチド、例えばＧＬＰ−１（７−３６）並びにその天然及び非天然対応物などを形成するために非常に有用である。
公开号:JP2011506376A
申请号:JP2010537379
申请日:2008-12-02
公开日:2011-03-03
发明作者:チェン，リン；ハン，ユン−クウェイ；ロバーツ，クリストファー・アール
申请人:エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ；
IPC主号:C07K1-06

专利说明:

[0001] 本発明は、固相プロセス及び液相プロセスを使用した、インシュリン分泌性ペプチド、特にグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）及びその対応物を調製するための方法に関する。本発明は、さらに、これらの方法において使用することができる中間体ペプチドフラグメントに関する。]
[0002] ペプチド合成のための多くの方法が、文献において記載されている（例えば、米国特許第６，０１５，８８１号；Mergler et al. (1988) Tetrahedron Letters 29: 4005-4008；Mergler et al. (1988) Tetrahedron Letters 29: 4009-4012；Kamber et al. (eds), Peptides, Chemistry and Biology,ESCOM, Leiden (1992) 525-526；Riniker et al. (1993) Tetrahedron Letters 49: 9307-9320；Lloyd-Williams et al. (1993) Tetrahedron Letters 49: 11065-11133；及びAndersson et al. (2000) Biopolymers 55: 227-250を参照のこと）。合成の種々の方法が、合成が起こる相の物理的状態（即ち、液相又は固相）により区別される。]
[0003] 固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）では、アミノ酸基又はペプチド基を、固体の支持体樹脂に結合させる。次に、連続アミノ酸基又はペプチド基を、目的のペプチド材料が形成されるまで、支持体結合ペプチドに付着させる。支持体結合ペプチドを次に、典型的には、支持体から切断して、さらなるプロセシング及び／又は精製に供する。一部の場合では、固相合成は成熟ペプチド産物を産生するし；他の場合では、支持体から切断されたペプチド（即ち、「ペプチド中間体フラグメント」）をより大きな成熟ペプチド産物の調製において使用する。]
[0004] 固相プロセスから生成されるペプチド中間体フラグメントを、固相又は液相合成プロセスにおいて一緒に結合させることができる（本明細書において「溶液相合成」と呼ぶ）。溶液相合成は、固相による有用な成熟ペプチドの合成が不可能である又は実用的ではない場合において特に有用でありうる。例えば、固相合成において、より長いペプチドが最終的に不規則な立体構造をとりながら、依然として固体支持体に付着していることがあり、追加のアミノ酸又はペプチド材料を成長鎖に付加することが困難になる。ペプチド鎖が支持体樹脂上で長くなるほど、プロセス工程（例えば、結合及び脱保護など）の効率は損なわれうる。これは、次には、出発材料（例えば、活性化可能なアミノ酸、共試薬、及び溶媒など）における増加性の損失に加えて、これらの問題を代償するためのより長いプロセシング時間を招きうる。これらの問題は、ペプチドの長さが増加するにつれて増加しうる。]
[0005] 従って、固相手順だけを使用して３０アミノ酸長より大きな成熟ペプチドが単一フラグメントにおいて合成されることを見出すことは比較的稀である。代わりに、個々のフラグメントを固相上で別々に合成し、そして次に固相及び／又は溶液相において結合させて、所望のペプチド産物を構築してよい。このアプローチは、フラグメント候補の慎重な選択を要求する。一部の一般的な原理によってフラグメント選択を導くことができるが、非常にしばしば、フラグメント候補の経験的なテストが要求される。１つの状況において上手くいくフラグメント戦略が、他において上手くいかないことがある。合理的なフラグメント候補が明らかにされている場合でさえ、プロセス革新が、依然として、合成戦略が商業的に合理的な条件下で上手くいくために必要とされうる。従って、ハイブリッドスキームを使用したペプチド合成はしばしば難しく、多くの場合において、合成スキームにおいて何が固有の問題であるのかを予測することは、実際の合成が実施されるまで困難である。]
[0006] 溶液相での結合では、２つのペプチド中間体フラグメント、又はペプチド中間体フラグメント及び反応性アミノ酸を、適切な溶媒中で、通常、結合反応の効率及び質を促進させる追加試薬の存在において結合させる。ペプチド中間体フラグメントを反応性に配置して、１つのフラグメントのＮ末端を他のフラグメントのＣ末端に結合させる、又は逆も同様である。また、側鎖保護基が、固相合成中に存在し、溶液相での結合中に共通してフラグメント上に保持されて、フラグメントの末端の特異的な反応性を保証する。これらの側鎖保護基は、典型的には、成熟ペプチドが形成されるまで除去されない。]
[0007] 全合成スキーム中の１つ又は複数の工程における適度の改善は、成熟ペプチドの調製における有意な改善に相当しうる。そのような改善は、時間及び試薬における大きな全節約を導くことができ、また、最終産物の純度及び収率を有意に改善することができる。]
[0008] ハイブリッド合成における改善の重要性に関する考察を、これらの手順を使用して産生される任意の種類のペプチドに適用可能であり、それは、治療的に有用であり、及び、商業的な医学的使用のための規模で製造されるペプチドに関連して特に重要である。より大きな生体分子医薬品、例えば治療用ペプチドなどの合成は、非常に高価となりうる。他の要素に加えて、試薬の費用、合成時間、多くの合成工程のため、これらのより大きな生体分子医薬品の合成プロセスでは非常に小さな改善でも、そのような医薬品を産生することが経済的にも実行可能であるか否かに有意な影響を有しうる。そのような改善が、より大きな生体分子医薬品のためのこれらの高い産生費用のため必要であり、多くの場合において、これらのタイプのより大きな生体分子医薬品のための適した治療用代替物は（仮にあるとしても）少ないとの事実により裏付けられる。]
[0009] このことは、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）及びその対応物の場合において明らかに見られる。これらのペプチドは、２型インスリン非依存性糖尿病並びに関連する代謝障害、例えば肥満などの処置のための可能な治療剤として意味付けられてきた。Gutniak, M.K., et al., Diabetes Care 1994: 17: 1039-44。]
[0010] Lopez et al.は、天然ＧＬＰ−１が３７個のアミノ酸残基長であることを決定した。Lopez, L. C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 80: 5485-5489 (1983)。この決定は、Uttenthal, L. O., et al., J. Clin. Endocrinal. Metabol., 61: 472-479 (1985)の研究により確認された。天然ＧＬＰ−１は、表示ＧＬＰ−１（１−３７）により表わしてよい。この表示は、ペプチドが１（Ｎ末端）から３７（Ｃ末端）の全てのアミノ酸を有することを示す。天然ＧＬＰ−１（１−３７）は配列番号１：




のアミノ酸配列を有する。]
[0011] 天然ＧＬＰ−１（１−３７）は、一般的に、インシュリン生合成を媒介することはできないが、しかし、このペプチドの生物学的に重要なフラグメントはインシュリン分泌特性を有する。例えば、配列番号２




の天然の３１アミノ酸長のペプチドＧＬＰ−１（７−３７）はインシュリン分泌性であり、天然ＧＬＰ−１の７（Ｎ末端）から３７（Ｃ末端）の位置のアミノ酸を有する。ＧＬＰ−１（７−３７）は末端グリシンを有する。このグリシンが存在しない場合、結果として生じるペプチドは依然としてインシュリン分泌的に活性であり、配列番号３：




のＧＬＰ−１（７−３６）と呼ばれる。]
[0012] ＧＬＰ−１（７−３６）は、しばしば、Ｃ末端アルギニンと共にアミド化型で存在し、この型は、表示ＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２により表わしてよい。]
[0013] ＧＬＰ−１（１−３７）は、一般的に、インシュリン分泌的に活性なその対応物にインビボで変換される。例えば、ＧＬＰ−１（１−３７）は、自然に、ＧＬＰ−１（７−３７）にインビボで変換される。このペプチドは、次には、Ｃ末端グリシンのタンパク質分解除去による追加のプロセシングも受け、ＧＬＰ−１（７−３６）を産生し、それはしばしばアミド化型ＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２で存在する。それ故に、治療処置は、ＧＬＰ−１（１−３７）又はその対応物の投与を含んでよく、インシュリン分泌的に活性なその誘導体がインビボで形成することを期待する。より共通して、しかし、研究中の治療処置は、インシュリン分泌的に活性なＧＬＰ−１フラグメント自体の投与を含む。]
[0014] ＵＳ ６，８８７，８４９によると、ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）、及びＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２のインシュリン分泌活性は、膵臓ベータ細胞に特異的であるらしいが、ここでこれらのペプチドはインシュリンの生合成を誘導するらしい。これによって、これらのペプチド及び医薬的に許容可能なその対応物が、成人発症糖尿病の病因（インシュリン分泌の動態が異常である高血糖により特徴付けられる状態）の試験において有用になる。さらに、これらのグルカゴン様ペプチドは、この疾患の治療及び処置、並びに高血糖の治療及び処置において有用でありうる。ＥＰ １１３７６６７ Ｂ１によると、これらのペプチド又は医薬的に許容可能なその対応物は、他の型の糖尿病、肥満、グルカゴノーマ、気道の分泌障害、代謝障害、関節炎、骨粗鬆症、中枢神経系疾患、再狭窄、神経変性疾患、腎不全、鬱血性心不全、ネフローゼ症候群、肝硬変、肺浮腫、高血圧症、及び／又は食物摂取量の低下が望ましい障害を処置するためにも有用でありうる。]
[0015] 天然ＧＬＰ−１（１−３７）及び配列番号１〜３の天然のインシュリン分泌的に活性なその対応物は、代謝的に不安定であり、インビボでわずか１〜２分間の血漿中半減期を有する。外因的に投与されたＧＬＰ−１も迅速に分解される。この代謝的な不安定性によって、天然ＧＬＰ−１及びその天然フラグメントの治療潜在力は限定されてきた。]
[0016] 改善された安定性を伴うＧＬＰ−１ペプチドの合成対応物が、開発されてきた。例えば、配列番号４：




のペプチドがＥＰ １１３７６６７ Ｂ１において記載されている。]
[0017] このペプチドは、アルファ−アミノイソ酪酸（模式的に略語Ａｉｂにより示す）のアキラル残基が、８及び３５の位置で、これらの位置の対応する天然アミノ酸の代わりに現れることを除き、天然ＧＬＰ−１（７−３６）と類似である。アキラルアルファ−アミノイソ酪酸は、メチルアラニンとしても公知である。このペプチドは、化学式（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）又は、アミド化形状で、（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２により命名してよい。]
[0018] ＥＰ １１３７６６７ Ｂ１には、配列番号４のペプチド及びその対応物が、固相技術を使用して単一フラグメントとして構築することができることが記載されている。ＥＰ １１３７６６７ Ｂ１により示唆される単一フラグメント合成アプローチには問題がある。１つの問題として、このアプローチは、最終的なアミノ酸結合における高レベルのエピマー化（例えば（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）の場合におけるヒスチジン）を導きうる。また、不純物はクロマトグラフィー精製中に除去することが難しく、収率が低くなりすぎる傾向がありうる。結果的に、配列番号４のペプチドを合成するための改善された戦略が、このペプチド及びその対応物を商業的に許容可能な収率、純度、及び量で製造するために必要とされる。]
[0019] これらの懸念に加えて、産物の回収及びペプチドの大規模産生のための産物の純度、並びに試薬の取扱い、保存、及び処分に関連する問題が、ペプチド合成スキームの実行可能性に大きく影響を及ぼしうる。このように、商業目的のペプチド材料を、大バッチ量で、改善された収率で効率的に産生することが可能なペプチド合成プロセスについての継続的な必要が存在する。]
[0020] 本願は、固相及び溶液相（「ハイブリッド」）アプローチを使用して合成されるインシュリン分泌性ペプチドの調製に関する。１つの方法において、アプローチは、固相化学を使用して３つの異なるペプチド中間体フラグメントを合成することを含む。溶液相化学を次に使用して、追加のアミノ酸材料をフラグメントの１つに加える。フラグメントを、次に、溶液相において一緒に結合させる。フラグメントの１つにおける疑似プロリンの使用によって、そのフラグメントの固相合成が容易になり、また、このフラグメントの他のフラグメントへの後の溶液相結合が容易になる。本発明は、インシュリン分泌性ペプチド、例えばＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１（７−３６）並びにこれらの天然及び非天然対応物など、特にＧＬＰ−１（７−３６）並びにその天然及び非天然対応物を形成するために非常に有用である。]
[0021] 一局面において、本願は、インシュリン分泌性ペプチドを作る方法を提供し、以下の工程：
ａ）（配列番号５）




式中、
Ｘ３５は、アキラル、場合により立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメントを提供すること、
ｂ）（配列番号６）




式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを提供するために、第１のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
ｃ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号６）




式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを与えること、
ｄ）（配列番号７）




式中、
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第４のペプチドフラグメントを提供すること、
ｅ）（配列番号８）




式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第５のペプチドフラグメントを提供するために、第４のペプチドフラグメントを第３のペプチドフラグメントに溶液中で結合させること、
ｆ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号８）




式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第６のペプチドフラグメントを与えること、
ｇ）（配列番号９）




式中、
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；及び
Ｈ及びＥの各々は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第７のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
ｈ）第７のペプチドフラグメントを第６のペプチドフラグメントに溶液中で結合させて、（配列番号１０）




式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを提供すること、
を含む。]
[0022] 「Ｎ末端保護基」は、Ａｃｒ（アクリリル）、Ｂｚ（ベンゾイル）、Ａｃ（アセチル）、Ｔｒｔ（トリチル）Ｂｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）、ＣＢｚ（ベンジルオキシ−カルボニル又はＺ）、Ｄｔｓ（ジチアスクシノイル（dithiasuccinoyl））、Ｒｄｔｃ（Ｒ＝アルキル又はアリール、ｄｔｃ＝ジチオカルバメート）、ＤＢＦｍｏｃ（２，７−ジ−ｔ−ブチルＦｍｏｃ又は１，７−ジ−ｔ−ブチルフルオレン−９−イルメトキシカルボニル）、Ａｌｌｏｃ（アリルオキシカルボニル）、ｐＮＺ（ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル）、Ｎｓｃ（［［２−［（４−ニトロフェニル）スルホニル］−エトキシ］カルボニル］）、Ｍｓｃ（２−メチルスルホニルエトキシカルボニル）、ＭＢｚ（４−メトキシＣＢｚ）、Ｐｏｃ（２−フェニルプロピル（２）−オキシカルボニル）、Ｂｐｏｃ［（１−［１，１’−ビフェニル］−４−イル−１−メチルエトキシ）カルボニル］、Ｂｎｐｅｏｃ［［２，２−ビス（４−ニトロフェニル）−エトキシ］カルボニル］、ＣＢｚ［（フェニルメトキシ）カルボニル］、Ａｏｃ［（１，１−ジメチルプロポキシ）カルボニル］、及びＭｏｚ［［（４−メトキシフェニル）メトキシ］カルボニル］からなる群より選択される基を意味する。好ましいＮ末端保護基は、Ｆｍｏｃ、Ｂｐｏｃ、Ｔｒｔ、Ｐｏｃ、及びＢｏｃである。]
[0023] 「アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基」は、天然アキラルグリシン又は別のアキラルアミノ酸に由来しうるアミノ酸である。好ましくは、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基は、グリシン（Ｇ）、２−メチルアラニン（Ａｉｂ）、及び２−フェニルメチル−フェニルアラニンからなる群より選択される。最も好ましくは、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基は、Ｇ又はＡｉｂから選択される。]
[0024] 好ましい局面において、本願は、インシュリン分泌性ペプチドを作る方法を提供し、以下の工程：
ａ）（配列番号５）




式中、
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメントを提供すること、
ｂ）（配列番号６）




式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを提供するために、第１のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
ｃ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号６）




式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを与えること、
ｄ）（配列番号７）




式中、
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第４のペプチドフラグメントを提供すること、
ｅ）（配列番号８）




式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第５のペプチドフラグメントを提供するために、第４のペプチドフラグメントを第３のペプチドフラグメントに溶液中で結合させること、
ｆ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号８）




式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第６のペプチドフラグメントを与えること、
ｇ）（配列番号９）




式中、
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；及び
Ｈ及びＥの各々は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第７のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
ｈ）第７のペプチドフラグメントを第６のペプチドフラグメントに溶液中で結合させて、（配列番号１０）




式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを提供すること、
を含む。]
[0025] 別の局面において、本願は、さらに以下の工程：
ｉ）インシュリン分泌性ペプチドのＮ末端保護基を除去して、（配列番号１０）




式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを与えること、
及び
ｊ）アミノ酸側鎖を脱保護させて、（配列番号１１）




式中、
Ｚは、Ｈ−であり；及び
Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基である
のアミノ酸配列を含む脱保護インシュリン分泌性ペプチドを与えるために、工程ｉ）により得られるインシュリン分泌性ペプチドを酸と接触させること、
を含む、上の方法を提供する。]
[0026] さらに別の局面において、本願は上の方法を提供し、ここで脱保護されたインシュリン分泌性ペプチドはアミノ酸配列（配列番号１２）




を有する。]
[0027] 一局面において、本願は、インシュリン分泌性ペプチドを作る方法を提供し、以下の工程：
ａ）（配列番号５）




式中、
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメントを提供すること、
ｂ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号５）




式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを与えること、
ｃ）（配列番号７）




式中、
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを溶液中で提供すること、
ｄ）（配列番号１３）




式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第４のペプチドフラグメントを提供するために、第３のペプチドフラグメントを溶液中で第２のペプチドフラグメントに結合させること、
ｅ）（配列番号８）




式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第５のペプチドフラグメントを提供するために、第４のペプチドフラグメントを固相樹脂から除去して、第４のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
ｆ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号８）




式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第６のペプチドフラグメントを与えること、
ｇ）（配列番号９）




式中、
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；及び
Ｈ及びＥの各々は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第７のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
ｈ）第７のペプチドフラグメントを第６のペプチドフラグメントに溶液中で結合させて、（配列番号１０）




式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを提供すること、
を含む。]
[0028] 好ましい局面において、本願は、インシュリン分泌性ペプチドを作る方法を提供し、以下の工程：
ａ）（配列番号５）




式中、
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメントを提供すること、
ｂ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号５）




式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを与えること、
ｃ）（配列番号７）




式中、
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを溶液中で提供すること、
ｄ）（配列番号１３）




式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第４のペプチドフラグメントを提供するために、第３のペプチドフラグメントを溶液中で第２のペプチドフラグメントに結合させること、
ｅ）（配列番号８）




式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第５のペプチドフラグメントを提供するために、第４のペプチドフラグメントを固相樹脂から除去して、第４のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
ｆ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号８）




式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第６のペプチドフラグメントを与えること、
ｇ）（配列番号９）




式中、
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；及び
Ｈ及びＥの各々は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第７のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
ｈ）第７のペプチドフラグメントを第６のペプチドフラグメントに溶液中で結合させて、（配列番号１０）




式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを提供すること、
を含む。]
[0029] 別の局面において、本願は、さらに以下の工程：
ｉ）インシュリン分泌性ペプチドのＮ末端保護基を除去して、（配列番号１０）




式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを与えること、
及び
ｊ）アミノ酸側鎖を脱保護させて、（配列番号１１）




式中、
Ｚは、Ｈ−であり；及び
Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基である
のアミノ酸配列を含む脱保護インシュリン分泌性ペプチドを与えるために、工程ｉ）により得られるインシュリン分泌性ペプチドを酸と接触させること、
を含む、上の方法を提供する。]
[0030] さらに別の局面において、本願は上の方法を提供し、ここで脱保護されたインシュリン分泌性ペプチドはアミノ酸配列（配列番号１２）




を有する。]
[0031] 「固相樹脂」は、固相ペプチド合成の実行において適した任意の型の支持体を意味し、１つ又は複数のポリマー、コポリマー、又はポリマー（例えば、ポリアミド、ポリスルファミド、置換ポリエチレン、ポリエチレングリコール、フェノール樹脂、ポリサッカライド、又はポリスチレンなど）の組み合わせから作ることができ、及び、典型的に、成長ペプチドが合成中に結合される連結成分を含む。好ましくは、固相樹脂は、２−クロロトリチルクロリド（２−ＣＴＣ）樹脂、トリチルクロリド樹脂、４−メチルトリチルクロリド樹脂、４−メトキシトリチルクロリド樹脂、４−アミノブタン−１−オール２−クロロトリチル樹脂、４−アミノメチルベンゾイル２−クロロトリチル樹脂、３−アミノプロパン−１−オール２−クロロトリチル樹脂、ブロモ酢酸２−クロロトリチル樹脂、シアン酢酸２−クロロトリチル樹脂、４−シアノ安息香酸２−クロロトリチル樹脂、グリシノール２−クロロトリチル樹脂、プロピオン酸２−クロロトリチル樹脂、エチレングリコール２−クロロトリチル樹脂、Ｎ−Ｆｍｏｃヒドロキシルアミン２−クロロトリチル樹脂、ヒドラジン２−クロロトリチル樹脂、４−ヒドロキシメチルフェニルオキシメチル固定基を伴うポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂（ＰＳ樹脂）、及び４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸樹脂からなる群より選択される。最も好ましくは、固相樹脂は２−クロロトリチルクロリド（２−ＣＴＣ）樹脂である。]
[0032] 一局面において、本願は、インシュリン分泌性ペプチドを作る方法を提供し、以下の工程：
ａ）（配列番号１３）




式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基が、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメント又はその対応物を提供すること、
ｂ）（配列番号８）




式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを提供するために、第１のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
ｃ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号８）




式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを与えること、
ｄ）（配列番号９）




式中、
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；及び
Ｈ及びＥの各々は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第４のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
ｅ）第４のペプチドフラグメントを第３のペプチドフラグメントに溶液中で結合させて、（配列番号１０）




式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを提供すること、
を含む。]
[0033] 好ましい局面において、本願は、インシュリン分泌性ペプチドを作る方法を提供し、以下の工程：
ａ）（配列番号１３）




式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基が、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメント又はその対応物を提供すること、
ｂ）（配列番号８）




式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを提供するために、第１のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
ｃ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号８）




式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを与えること、
ｄ）（配列番号９）




式中、
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、−ＯＨであり；及び
Ｈ及びＥの各々は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第４のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
ｅ）第４のペプチドフラグメントを第３のペプチドフラグメントに溶液中で結合させて、（配列番号１０）




式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを提供すること、
を含む。]
[0034] 別の局面において、本願は、さらに以下の工程：
ｉ）インシュリン分泌性ペプチドのＮ末端保護基を除去して、（配列番号１０）




式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを与えること、
及び
ｊ）アミノ酸側鎖を脱保護させて、（配列番号１１）




式中、
Ｚは、Ｈ−であり；及び
Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基である
のアミノ酸配列を含む脱保護インシュリン分泌性ペプチドを与えるために、工程ｉ）により得られたインシュリン分泌性ペプチドを酸と接触させること、
を含む、上の方法を提供する。]
[0035] さらに別の局面において、本願は上の方法を提供し、ここで脱保護されたインシュリン分泌性ペプチドはアミノ酸配列（配列番号１２）




を有する。]
[0036] 上の方法のいずれも、以下からなる群より選択されるＮ末端ヒスチジン保護基（Ｎ末端保護基）を用いてよい：Ｂｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）、ＣＢｚ（ベンジルオキシカルボニル又はＺ）、Ｄｔｓ（ジチアスクシノイル（dithiasuccinoyl））、Ｒｄｔｃ（Ｒ＝アルキル又はアリール、ｄｔｃ＝ジチオカルバメート）、ＤＢＦｍｏｃ（２，７−ジ−ｔ−ブチルＦｍｏｃ又は１，７−ジ−ｔ−ブチルフルオレン−９−イルメトキシカルボニル）、Ａｌｌｏｃ（アリルオキシカルボニル）、ｐＮＺ（ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル）、Ｎｓｃ（［［２−［（４−ニトロフェニル）スルホニル］−エトキシ］カルボニル］）、Ｍｓｃ（２−メチルスルホニルエトキシカルボニル）、ＭＢｚ（４−メトキシＣＢｚ）、Ｂｐｏｃ［（１−［１，１’−ビフェニル］−４−イル−１−メチルエトキシ）カルボニル］、Ｂｎｐｅｏｃ［［２，２−ビス（４−ニトロフェニル）エトキシ］−カルボニル］、ＣＢｚ［（フェニルメトキシ）カルボニル］、Ａｏｃ［（１，１−ジメチルプロポキシ）カルボニル］、及びＭｏｚ［［（４−メトキシフェニル）メトキシ］カルボニル］。ここで、Ｎ末端ヒスチジン保護基を、酸を使用した全体的な側鎖脱保護工程において除去してよい場合、Ｎ末端ヒスチジン保護基の先の除去は要求されない。]
[0037] 一局面において、本願はアミノ酸配列（配列番号１４）




式中、
Ｚは、Ｈ−及びＦｍｏｃ−から選択され；
Ｂ’は、−ＯＨ又は固相樹脂であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のペプチドを提供する。]
[0038] 別の局面において、本願は上のペプチドを提供し、ここで疑似プロリンのジペプチド残基はＳｅｒ−Ｓｅｒ残基である。]
[0039] 一局面において、本願はアミノ酸配列（配列番号１５）




式中、
Ｚは、Ｈ−及びＦｍｏｃ−から選択され；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のペプチドを提供する。]
[0040] 別の局面において、本願は上のペプチドを提供し、ここで疑似プロリンのジペプチド残基はＳｅｒ−Ｓｅｒ残基である。]
[0041] 本願は、固相及び溶液相（「ハイブリッド」）アプローチを使用して合成されるインシュリン分泌性ペプチドの調製に関する。一般的に、アプローチは、固相化学を使用して３つの異なるペプチド中間体フラグメントを合成することを含む。溶液相化学を次に使用して、追加のアミノ酸材料をフラグメントの１つに加える。フラグメントを、次に、溶液相において一緒に結合させる。フラグメントの１つにおける疑似プロリンの使用によって、そのフラグメントの固相合成が容易になり、また、このフラグメントの他のフラグメントへの後の溶液相結合が容易になる。本発明は、インシュリン分泌性ペプチド、例えばＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１（７−３６）並びにこれらの天然及び非天然対応物など、特にＧＬＰ−１（７−３６）並びにその天然及び非天然対応物を形成するために非常に有用である。]
[0042] 一局面において、本願は、インシュリン分泌性ペプチドを作る方法を提供し、以下の工程：
ａ）（配列番号１６）




式中、
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメントを提供すること、
ｂ）工程ａ）の第１のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第１のペプチドフラグメントを溶液中（配列番号１６）




式中、Ｂ’は、−ＯＨである；
で産生させること、
ｃ）（配列番号１７）




式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを提供するために、第１のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
ｄ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号１７）




式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを与えること、
を含む。]
[0043] 「Ｎ末端保護基」は、Ａｃｒ（アクリリル）、Ｂｚ（ベンゾイル）、Ａｃ（アセチル）、Ｔｒｔ（トリチル）、Ｂｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）、ＣＢｚ（ベンジルオキシカルボニル又はＺ）、Ｄｔｓ（ジチアスクシノイル（dithiasuccinoyl））、Ｒｄｔｃ（Ｒ＝アルキル又はアリール、ｄｔｃ＝ジチオカルバメート）、ＤＢＦｍｏｃ（２，７−ジ−ｔ−ブチルＦｍｏｃ又は１，７−ジ−ｔ−ブチルフルオレン−９−イルメトキシカルボニル）、Ａｌｌｏｃ（アリルオキシカルボニル）、ｐＮＺ（ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル）、Ｎｓｃ（［［２−［（４−ニトロフェニル）スルホニル］エトキシ］カルボニル］）、Ｍｓｃ（２−メチルスルホニルエトキシカルボニル）、ＭＢｚ（４−メトキシＣＢｚ）、Ｐｏｃ（２−フェニルプロピル（２）−オキシカルボニル）、Ｂｐｏｃ［（１−［１，１’−ビフェニル］−４−イル−１−メチルエトキシ）カルボニル］、Ｂｎｐｅｏｃ［［２，２−ビス（４−ニトロフェニル）エトキシ］カルボニル］、ＣＢｚ［（フェニルメトキシ）カルボニル］、Ａｏｃ［（１，１−ジメチルプロポキシ）カルボニル］、及びＭｏｚ［［（４−メトキシフェニル）メトキシ］カルボニル］からなる群より選択される。好ましいＮ末端保護基はＦｍｏｃ、Ｂｐｏｃ、Ｔｒｔ、Ｐｏｃ及びＢｏｃである。]
[0044] 好ましい局面において、本願は、インシュリン分泌性ペプチドを作る方法を提供し、以下の工程：
ａ）（配列番号１６）





式中、
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメントを提供すること、
ｂ）工程ａ）の第１のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第１のペプチドフラグメントを溶液中（配列番号１６）




式中、Ｂ’は、−ＯＨである；
で産生させること、
ｃ）（配列番号１７）




式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを提供するために、第１のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
ｄ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号１７）




式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを与えること、
を含む。]
[0045] 一局面において、本願は、アミノ酸配列（配列番号１７）




式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；及び
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
を有する上の方法に従って調製されるペプチドを提供する。]
[0046] 上のペプチドの１つの変異において、Ｘ３５はＡｉｂである。]
[0047] 一局面において、本願は、アミノ酸配列（配列番号１６）




式中、
Ｂ’は、固相樹脂又は−ＯＨであり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；及び
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
を有する上の方法に従って調製されるペプチドを提供する。]
[0048] 上のペプチドの１つの変異において、Ｘ３５はＡｉｂである。]
[0049] 一局面において、本願は、インシュリン分泌性ペプチドを作る方法を提供し、以下の工程：
ａ）（配列番号１８）




式中、
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含むペプチドフラグメントを提供すること、
及び
ｂ）工程ａ）のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、ペプチドフラグメントを溶液中（配列番号１８）




式中、Ｂ’は、−ＯＨである
で産生させること、
を含む。]
[0050] 好ましい局面において、本願は、インシュリン分泌性ペプチドを作る方法を提供し、以下の工程：
ａ）（配列番号１８）




式中、
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含むペプチドフラグメントを提供すること、
及び
ｂ）工程ａ）のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、ペプチドフラグメントを溶液中（配列番号１８）




式中、Ｂ’は、−ＯＨである
で産生させること、
を含む。]
[0051] 一局面において、本願は、以下の工程：
ａ）（配列番号１６）




式中、
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメントを提供すること、
ｂ）工程ａ）の第１のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第１のペプチドフラグメントを溶液中（配列番号１６）




式中、Ｂ’は、−ＯＨである；
で産生させること、
ｃ）（配列番号１７）




式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを提供するために、第１のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
ｄ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号１７）




式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを与えること、
及び
ｅ）（配列番号１８）




式中、
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第４のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
ｆ）工程ｅ）の第４のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第４のペプチドフラグメントを溶液中（配列番号１８）




式中、Ｂ’は、−ＯＨである
で産生させること、
を含む方法を提供する。]
[0052] 好ましい局面において、本願は、以下の工程：
ａ）（配列番号１６）




式中、
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメントを提供すること、
ｂ）工程ａ）の第１のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第１のペプチドフラグメントを溶液中（配列番号１６）




式中、Ｂ’は、−ＯＨである；
で産生させること、
ｃ）（配列番号１７）




式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを提供するために、第１のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
ｄ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号１７）




式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを与えること、
及び
ｅ）（配列番号１８）




式中、
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第４のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
ｆ）工程ｅ）の第４のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第４のペプチドフラグメントを溶液中（配列番号１８）




式中、Ｂ’は、−ＯＨである
で産生させること、
を含む方法を提供する。]
[0053] 一局面において、本願は、インシュリン分泌性ペプチドを作る方法を提供し、以下の工程：
ａ）（配列番号１０）




式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを提供するために、第１のペプチドフラグメントを第２のペプチドフラグメントに溶液中で結合させること、
を含む。]
[0054] 好ましくは、Ｎ末端保護基はＦｍｏｃである。]
[0055] 一局面において、本願は、以下の工程：
ａ）（配列番号１６）




式中、
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメントを提供すること、
ｂ）工程ａ）の第１のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第１のペプチドフラグメントを溶液中（配列番号１６）




式中、Ｂ’は、−ＯＨである；
で産生させること、
ｃ）（配列番号１７）




式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを提供するために、第１のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
ｄ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号１７）




式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを与えること、
及び
ｅ）（配列番号１８）




式中、
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第４のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
ｆ）工程ｅ）の第４のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第４のペプチドフラグメントを溶液中（配列番号１８）




式中、Ｂ’は、−ＯＨである；
で産生させること、
ｇ）（配列番号１０）




式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含む第５のペプチドフラグメントを提供するために、第４のペプチドフラグメントを第３のペプチドフラグメントに溶液中で結合させること、
を含む方法を提供する。]
[0056] 好ましくは、Ｎ末端保護基はＦｍｏｃである。]
[0057] 一局面において、本願は、以下の工程：
ａ）（配列番号１６）




式中、
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメントを提供すること、
ｂ）工程ａ）の第１のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第１のペプチドフラグメントを溶液中（配列番号１６）




式中、Ｂ’は、−ＯＨである；
で産生させること、
ｃ）（配列番号１７）




式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを提供するために、第１のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
ｄ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号１７）




式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを与えること、
及び
ｅ）（配列番号１８）




式中、
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第４のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
ｆ）工程ｅ）の第４のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第４のペプチドフラグメントを溶液中（配列番号１８）




式中、Ｂ’は、−ＯＨである；
で産生させること、
ｇ）（配列番号１０）




式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第５のペプチドフラグメントを提供するために、第４のペプチドフラグメントを第３のペプチドフラグメントに溶液中で結合させること、
ｈ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号１０）




式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含む第６のペプチドフラグメントを与えること、
を含む方法を提供する。]
[0058] 好ましくは、Ｎ末端保護基はＦｍｏｃである。]
[0059] 一局面において、本願は、以下の工程：
ａ）（配列番号１６）




式中、
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメントを提供すること、
ｂ）工程ａ）の第１のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第１のペプチドフラグメントを溶液中（配列番号１６）




式中、Ｂ’は、−ＯＨである；
で産生させること、
ｃ）（配列番号１７）




式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを提供するために、第１のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
ｄ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号１７）




式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを与えること、
及び
ｅ）（配列番号１８）




式中、
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；
Ｂ’は、固相樹脂であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第４のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
ｆ）工程ｅ）の第４のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第４のペプチドフラグメントを溶液中（配列番号１８）




式中、Ｂ’は、−ＯＨである；
で産生させること、
ｇ）（配列番号１０）




式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり；
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第５のペプチドフラグメントを提供するために、第４のペプチドフラグメントを第３のペプチドフラグメントに溶液中で結合させること、
ｈ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号１０）




式中、
Ｚは、Ｈ−であり；
Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；
Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；
のアミノ酸配列を含む第６のペプチドフラグメントを与えること、
及び
ｉ）アミノ酸側鎖を脱保護させて、（配列番号１１）




式中、
Ｚは、Ｈ−であり；及び
Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基である
のアミノ酸配列を含む脱保護インシュリン分泌性ペプチドを与えるために、工程ｈ）により得られたインシュリン分泌性ペプチドを酸と接触させること、
を含む方法を提供する。]
[0060] 一局面において、本願は上の方法を提供し、ここで脱保護されたインシュリン分泌性ペプチドはアミノ酸配列（配列番号１２）




を有する。]
[0061] 一局面において、本願はアミノ酸配列（配列番号１８）




式中、
Ｚは、Ｈ−及びＦｍｏｃ−から選択され；
Ｂ’は、−ＯＨ又は固相樹脂であり；
Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；及び
前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のペプチドを提供する。]
[0062] 上のペプチドの１つの変異において、疑似プロリンのジペプチド残基はＳｅｒ−Ｓｅｒ残基である。]
[0063] 一局面において、上の方法のいずれかで、以下からなる群より選択されるＮ末端ヒスチジン保護基（Ｎ末端保護基）を用いてよい：Ｂｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）、ＣＢｚ（ベンジルオキシカルボニル又はＺ）、Ｄｔｓ（ジチアスクシノイル（dithiasuccinoyl））、Ｒｄｔｃ（Ｒ＝アルキル又はアリル、ｄｔｃ＝ジチオカルバメート）、ＤＢＦｍｏｃ（２，７−ジ−ｔ−ブチルＦｍｏｃ又は１，７−ジ−ｔ−ブチルフルオレン−９−イルメトキシカルボニル）、Ａｌｌｏｃ（アリルオキシカルボニル）、ｐＮＺ（ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル）、Ｎｓｃ（［［２−［（４−ニトロフェニル）スルホニル］エトキシ］カルボニル］）、Ｍｓｃ（２−メチルスルホニルエトキシカルボニル）、ＭＢｚ（４−メトキシＣＢｚ）、Ｂｐｏｃ［（１−［１，１’−ビフェニル］−４−イル−１−メチルエトキシ）カルボニル］、Ｂｎｐｅｏｃ［［２，２−ビス（４−ニトロフェニル）エトキシ］カルボニル］、ＣＢｚ［（フェニルメトキシ）カルボニル］、Ａｏｃ［（１，１−ジメチルプロポキシ）カルボニル］、及びＭｏｚ［［（４−メトキシフェニル）メトキシ］カルボニル］。ここで、Ｎ末端ヒスチジン保護基を、酸を使用した全体的な側鎖脱保護工程において除去してよい場合、Ｎ末端ヒスチジン保護基の先の除去は要求されない。]
[0064] 以下に記載する本発明の実施態様は、包括的であること、又は、本発明を、以下の詳細な説明において開示する正確な形状に限定することを意図しない。むしろ、実施態様を選び、そして記載して、当業者が本発明の原理及び実行を評価及び理解することができる。]
[0065] 本発明は、固相及び／又は溶液相技術を使用した、ペプチド、例えばグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、並びに天然及び非天然のインシュリン分泌的に活性なその対応物を作るための合成方法に向けられる。本発明のペプチド分子は、保護、無保護、又は部分的に保護してよい。保護は、Ｎ末端保護、側鎖保護、及び／又はＣ末端保護を含みうる。本発明は、一般的に、これらのグルカゴン様ペプチド、それらの対応物、フラグメント及びそれらの対応物、並びにこれらの融合産物及びそれらの対応物の合成に向けられ、本明細書における発明の教示は、また、他のペプチド、特に、固相及び溶液相アプローチの組み合わせを使用して合成されるものの合成に適用可能である。本発明は、また、不純物、特にピログルタミン酸不純物に関連するペプチド中間体フラグメントの合成に適用可能である。本発明の実行において有用である好ましいＧＬＰ−１分子は、天然及び非天然のＧＬＰ−１（７−３６）並びにその対応物を含む。]
[0066] 本明細書において使用する「アミノ酸配列を含む」という用語は、好ましくは「アミノ酸配列を有する」を意味する。]
[0067] 本明細書において使用する「対応物」は、ペプチドの天然及び非天然のアナログ、誘導体、融合化合物、塩、又は同様のものを指す。本明細書において使用するペプチドアナログは、一般的に、例えば、別のペプチド又はペプチド対応物と比べて、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失、逆位、及び／又は付加などにより改変アミノ酸配列を有するペプチドを指す。置換は、１つ又は複数の天然又は非天然のアミノ酸を含みうる。置換は、好ましくは、保存的又は高度に保存的でありうる。保存的置換は、一般的に同じ正味の電子電荷並びに一般的に同じサイズ及び形態を有する別のアミノ酸を用いたアミノ酸の置換を指す。例えば、脂肪族又は置換脂肪族アミノ酸側鎖を伴うアミノ酸は、それらの側鎖における炭素及びヘテロ原子の総数が約４個以下で異なる場合、おおよそ同じサイズを有する。それらは、それらの側鎖における分岐の数が約１又は２個以下で異なる場合、おおよそ同じ形態を有する。それらの側鎖においてフェニル又は置換フェニル基を伴うアミノ酸は、ほぼ同じサイズ及び形態を有すると考えられる。以下にアミノ酸の５グループを列挙する。化合物中のアミノ酸を、同じグループからの別のアミノ酸を用いて置換することによって、一般的に、保存的置換がもたらされる。]
[0068] グループＩ：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、及びＣ１−Ｃ４脂肪族又はＣ１−Ｃ４ヒドロキシル置換脂肪族側鎖（直鎖又は単一分岐）を伴う非天然アミノ酸。]
[0069] グループＩＩ：グルタミン酸、アスパラギン酸、及びカルボン酸置換Ｃ１−Ｃ４脂肪族側鎖（非分岐又は一分岐点）を伴う非天然アミノ酸。]
[0070] グループＩＩＩ：リジン、オルニチン、アルギニン、及びアミン又はグアニジノ置換Ｃ１−Ｃ４脂肪族側鎖（非分岐又は一分岐点）を伴う非天然アミノ酸。]
[0071] グループＩＶ：グルタミン、アスパラギン、及びアミド置換Ｃ１−Ｃ４脂肪族側鎖（非分岐又は一分岐点）を伴う非天然アミノ酸。]
[0072] グループＶ：フェニルアラニン、フェニルグリシン、チロシン、及びトリプトファン。]
[0073] 本明細書において使用する「対応物」という用語は、より好ましくはペプチドの塩、又はＣ末端でアミド化されたその誘導体を指す。]
[0074] 「高度に保存的な置換」は、側鎖中の同じ官能基並びにほとんど同じサイズ及び形態を有する別のアミノ酸を用いたアミノ酸の置換である。脂肪族又は置換脂肪族アミノ酸側鎖を伴うアミノ酸は、それらの側鎖における炭素及びヘテロ原子の総数が約２個以下で異なる場合、ほとんど同じサイズを有する。それらは、同じ数の分岐をそれらの側鎖において有する場合、ほとんど同じ形態を有する。高度に保存的な置換の例は、バリンとロイシン、スレオニンとセリン、アスパラギン酸とグルタミン酸、及びフェニルグリシンとフェニルアラニンを含む。]
[0075] 「ペプチド誘導体」は、一般的に、ペプチド、ペプチドアナログ、又はその側基の１つ又は複数の化学修飾を有する他のペプチド対応物、アルファ炭素原子、末端アミノ基、及び／又は末端カルボキシル酸基を指す。例として、化学修飾は、限定はされないが、化学的部分の付加、新たな結合の作成、及び／又は化学的部分の除去を含む。アミノ酸側基での修飾は、限定なしに、リジンｅ−アミノ基のアシル化、アルギニン、ヒスチジン又はリジンのＮ−アルキル化、グルタミン酸又はアスパラギン酸カルボン酸基のアルキル化、及びグルタミン又はアスパラギンの脱アミノを含む。末端アミノ基の修飾は、限定なしに、デス−アミノ、Ｎ−低級アルキル、Ｎ−ジ−低級アルキル、及びＮ−アシル（例、−ＣＯ−低級アルキル）修飾を含む。末端カルボキシ基の修飾は、限定なしに、アミド、低級アルキルアミド、ジアルキルアミド、及び低級アルキルエステルの修飾を含む。このように、部分的に又は全体的に保護されたペプチドは、ペプチド誘導体を構成する。]
[0076] 本発明の実行において、化合物は、それがホルモンインシュリンの合成又は発現を刺激する、又は刺激を起こす、又は刺激を起こす助けをすることができる場合、「インシュリン分泌」活性を有する。好ましい実行方法において、インシュリン分泌活性は、米国特許第６，８８７，８４９号及び第６，７０３，３６５号において記載されるアッセイに従って実証することができる。]
[0077] 好ましい実施態様において、本発明は、以下の化学式を有する合成（Ｘ８、Ｘ１０、Ｘ３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチド（配列番号１９）：




（式中、位置８、１０及び３５の記号Ｘの各々は、非依存的に、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基を表示する）及びその対応物を合成するための方法論を提供する。Ｘ８、Ｘ１０及び／又はＸ３５残基のいずれかが、場合により、側鎖保護基を含みうる。この化学式のペプチドは、少なくとも、アキラル、場合により、立体障害されたＸ８及びＸ３５残基が、位置８及び３５で、天然アミノ酸残基で置換されている点で、天然ＧＬＰ−１（７−３６）とは異なる。Ｘ１０残基は、天然アキラルグリシン又は別のアキラルアミノ酸に由来しうる。アキラルＸ８、Ｘ１０及びＸ３５アミノ酸の使用によって、結果として生じるペプチドの安定化が助けられるだけでなく、構築要素のリンカーとしてのこれらのアミノ酸の使用によって、スキーム１において示され、以下でさらに記載される本発明の合成経路を促進することも発見した。]
[0078] 本発明の原理に従って合成されうる（Ｘ８、Ｘ１０、Ｘ３５）ＧＬＰ−１１（７−３６）ペプチドの特に好ましい実施態様は、式（配列番号１２）：




（それは好ましくは（示す通り）Ｃ末端がアミド化されている）のペプチド及びその対応物を含む。このペプチドでは、アルファ−アミノイソ酪酸（模式的に略語Ａｉｂにより示す）のアキラル残基をＸ８及びＸ３５の両方として使用し、好ましくはＣ末端にアミドを有し、１０の位置に天然Ｇの残基を使用し、式（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２により命名してよい。この表示は、アミノ酸「Ａｉｂ」に対応するアミノ酸残基が、８及び３５の位置で天然アラニンの代わりに現れることを示す。アキラルアルファ−アミノイソ酪酸はまたメチルアラニンとして公知である。配列番号１２のペプチドがＥＰ １１３７６６７ Ｂ１において記載されている。８及び３５の位置でのＡｉｂ残基の存在によって、身体における代謝的分解が減速し、このペプチドを、身体において、天然ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドよりもずっと安定にする。]
[0079] 本発明は、ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチド、例えば（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２などを作るための改善された方法論を提供する。例として、スキーム１及びスキーム２は、ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチド及びそれらの対応物を合成するための２つの例示的スキームを示す。スキーム１及びスキーム２は、ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドのスケールアップ合成に特に適すると考えられる。スケールアップ手順を典型的に実施して、商業的流通のために有用な量のペプチドを提供する。例えば、スケールアップ手順におけるペプチドの量は、５００g、又は１kg/バッチ、より典型的に数十kg〜数百kg/バッチ又はそれ以上でありうる。好ましい実施態様において、本発明の方法は、プロセシング（合成）時間における低下、産物の収率における改善、産物純度における改善、及び／又は要求される試薬及び出発材料の量の低下などの改善を提供することができる。]
[0080] スキーム１において示す合成では、固相及び溶液相技術の組み合わせを使用し、ペプチド産物を調製する。]
[0081] ]
[0082] 示す通り、スキーム１は、ペプチド中間体フラグメント１、２及び３を固相上で合成することを含む。フラグメント１は、配列番号２０：




（式中、Ｘ８及びＸ１０は上に定義する通りである）のアミノ酸残基を含むペプチドフラグメントであるか、又はＸ８及びＸ１０残基を含むその対応物である。アミノ酸残基の１つ又は複数は、従来の実行に従い、側鎖保護基を含んでよい。一部の実施態様において、ペプチドフラグメント１２は、Ｃ末端を介して結合された樹脂でよい。このフラグメントは、場合により、Ｎ末端及び／又はＣ末端保護基を持ちうる。Ｆｍｏｃは、ペプチドフラグメントの固相合成及び溶液相又は固相結合に関して特に有用なＮ末端ヒスチジン保護基であることが見出されている。Ｔｒｔ（トリチル）も、ペプチドフラグメントの固相合成及び溶液相又は固相結合に関して特に有用なＮ末端ヒスチジン保護基であることが見出されている。Ｂｏｃ、ＣＢｚ、ＤＴＳ、Ｒｄｔｃ（Ｒ＝アルキル又はアリール）、ＤＢＦｍｏｃ（２，７−ジ−ｔ−ブチルＦｍｏｃ）、Ａｌｌｏｃ、ｐＮＺ（ｐ−ニトロベンジルエステル）、Ｎｓｃ（［［２−［（４−ニトロフェニル）スルホニル］エトキシ］カルボニル］−）、Ｍｓｃ（２−メチルスルホニルエトキシカルボニル）、及びＭＢｚ（４−メトキシＣＢｚ）も、ペプチドフラグメントの固相合成及び溶液相又は固相結合に関して特に有用なＮ末端ヒスチジン保護基である。［（１−［１，１’−ビフェニル］−４−イル−１−メチルエトキシ）カルボニル］、［［２，２−ビス（４−ニトロフェニル）エトキシ］カルボニル］、［（フェニルメトキシ）カルボニル］、［（１，１−ジメチルプロポキシ）カルボニル］、［［（４−メトキシフェニル）メトキシ］カルボニル］は、ペプチドフラグメントの固相合成及び溶液相又は固相結合に関して特に有用なＮ末端ヒスチジン保護基である。]
[0083] フラグメント１は、天然ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドの７から１０の位置におけるアミノ酸に対応する４個のアミノ酸残基を含み、従って、表示（Ｘ８，Ｘ１０）ＧＬＰ−１（７−１０）により表わしてよい。好ましい実施態様において、Ｘ８はＡｉｂであり、Ｘ１０は配列番号２１：




のグリシンであるか又は１０の位置にＡｉｂ残基を含むその対応物である。配列番号７のペプチドフラグメントは、表示（Ａｉｂ８）ＧＬＰ−１（７−１０）により表わしてよく、天然ＧＬＰ−１（７−１０）の８の位置の天然アラニンにおけるＡｉｂでの置換を記載する。]
[0084] 固相合成は、一般的に、フラグメント１のＣ末端からＮ末端の方向で行われる。このように、Ｘ１０アミノ酸は、フラグメントのＣ末端部分に存在し、固相樹脂支持体に結合される第１のアミノ酸残基である。固相合成は、次に、所望の配列に対応する様にアミノ酸残基を連続的に加えることにより進行する。ペプチド中間体フラグメントの合成は、Ｎ末端残基の後で完結しており、例えば、Ｎ末端ヒスチジン残基（Ｈ）が新生ペプチド鎖に加えられている。]
[0085] 配列番号２０及び２１のペプチドフラグメントの選択及び使用は、スキーム１内で有意な利点を提供する。第１に、Ｈ（ヒスチジン）は、少なくとも部分的にエピマー化の問題のために、成長中のペプチド鎖に付加することが困難なアミノ酸残基である傾向がある。しかし、フラグメント１は、これらの懸念の大部分を軽減するだけ十分に小さい。その上、フラグメント１は、２つのキラル中心を有するだけ十分に長い。このように、簡単な結晶化によってフラグメントを精製することが可能になる。フラグメント１がＡｉｂで終わる場合、フラグメントは１つだけキラル中心を有し、結果として、精製することがより困難になりうる。アキラルＧをＣ末端に位置づけることによっても、フラグメント１がキラルＥを伴うＣ末端で終わる場合に本来なら懸念になりうるラセミ化の懸念が回避される。要するに、ペプチド構築要素としてのフラグメント１の選択によって、フラグメントを構築し、それを精製し、そしてそれを他のペプチド材料に結合させることが簡単になる。フラグメント選択はＨの低ラセミ化も受ける。驚くべきことに、Ｈが、このフラグメントに、非常に低レベルのエピマー化（例、一部の実行方法において約０．５重量%）を伴い付加される。]
[0086] フラグメント２は、配列番号２２：




（式中、記号Ｘ１７−１８により表示される残基は、疑似プロリンのジペプチド残基（以下でさらに定義する）である）のアミノ酸残基を含むペプチドフラグメントであるか、又は１７及び１８の位置にＸ１７−１８を含むその対応物である。フラグメント２は、天然ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドの１１から２２の位置におけるアミノ酸残基に一般的に対応するアミノ酸残基を含む（疑似プロリンジペプチド残基Ｘ１７−１８が、天然ＧＬＰ−１（７−３６）の対応する１７及び１８位置を占めるＳＳ（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）残基の代わりに使用されることを除く）。]
[0087] フラグメント２のアミノ酸残基の１つ又は複数は、従来の実行に従い、側鎖保護基を含んでよい。一部の実施態様において、ペプチドフラグメント２は、Ｃ末端を介して結合された樹脂でよい。このフラグメントは、場合により、Ｎ末端及び／又はＣ末端保護基を持ちうる。Ｆｍｏｃは、ペプチドフラグメントの固相合成に関して特に有用なＮ末端保護基であることが見出されている。配列番号２２のペプチドフラグメントは、表示（Ｘ１７−１８）ＧＬＰ−１（１１−２２）により呼んでよく、１７及び１８の位置のＳｅｒ−Ｓｅｒ残基についてＸ１７−１８疑似プロリン残基での置換を記載する。]
[0088] 本発明の実行において使用する疑似プロリンという用語は、ヒドロキシル機能的アミノ酸の残基（例えばＳｅｒ又はＴｈｒなど）を含むジペプチドを指し、それにおいてヒドロキシル機能的側鎖は、アルファ−アミノと側鎖ヒドロキシルの間のプロリン様のＴＦＡ不安定オキサゾリジン環として保護される。オキサゾリジン環の結果として、ジペプチドは可逆的プロリン模倣体として機能する。]
[0089] 一般的に、ペプチド中に組み入れられる典型的な疑似プロリン残基を、化学式




により表わしてよい。
式中、Φは任意のアミノ酸の残基を表わし、Ｒ１及びＲ２の各々は非依存的に適した二価の連結部分である。しばしば、Ｒ１は、化学式




（式中、Ｒ３及びＲ４の各々は非依存的に一価の部分（例えばＨなど）、又は低級アルキル（例えばメチルなど）である）の二価の部分である。Ｒ３及びＲ４も環状構造の共通メンバーでありうる。望ましくは、Ｒ３及びＲ４の各々はメチルである。オキサゾリジニン（oxazolidinine）環−保護Ｓｅｒの場合において、Ｒ２は二価の部分ＣＨ２であり、Ｔｈｒの場合において、Ｒ２は二価の部分（ＣＨ３）ＣＨである。]
[0090] 「低級アルキル」という用語は、１〜６個の炭素原子、好ましくは１〜４個の炭素原子の分岐又は直鎖の一価アルキルラジカルを指す。この用語はさらに、ラジカル、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、３−メチルブチル、ｎ−ヘキシル、２−エチルブチル、及び同様のものにより例示される。好ましい低級アルキル残基は、メチル及びエチルであり、メチルが特に好ましい。]
[0091] 脱保護中に、Ｒ１部分が切断されて、以下の化学式：




（式中、Φ及びＲ２は上に定義された通りである）のジペプチド残基が提供される。フラグメント２に適用される通り、疑似プロリン残基は、好ましくは、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ残基に対応し、ここでＣ末端により近接したＳｅｒは、オキサゾリジン環と共に保護され、以下：




の構造を有する。]
[0092] Ｎ末端により近いＳｅｒのヒドロキシルを持つ側鎖が、例えばｔ−Ｂｕ保護基などにより保護される。保護オキサゾリジン環構造及びｔ−Ｂｕが切断されると、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ残基がもたらされる。]
[0093] フラグメント２の合成における構築要素としてのそのようなプロリン模倣体の使用は、本発明に関連する有意な利点を提供する。第１に、フラグメント２の固相合成が著しく簡単になる。疑似プロリンがフラグメント２の固相合成の過程において使用されない場合、残基１３から１１までのＦｍｏｃ除去に有意な問題が存在しうる。この困難はベータシート形成に起因しうると考えられる。疑似プロリンの使用によって、これらのＦｍｏｃ除去が、恐らくはベータシート形成の程度を低下させることにより、ずっと簡単になる。第２に、フラグメント２からフラグメント３の後の溶液相結合（スキーム１において描写される）が大幅に簡単になる。疑似プロリン残基の非存在において、典型的な溶液相結合溶媒中でのフラグメントの溶解度は非常に悪い。疑似プロリンは、フラグメント２（及びフラグメント２を組み入れるより長いフラグメント）の溶解度の特徴を増強し、フラグメント１の後の溶液相結合を簡単にする。]
[0094] 固相合成は、一般的に、フラグメント１のＣ末端からＮ末端の方向で行われる。このように、Ｇアミノ酸は、フラグメントのＣ末端部分に存在し、固相樹脂支持体に結合される第１のアミノ酸残基である。固相合成は、次に、所望の配列に対応する様態でアミノ酸残基を連続的に加えることにより進行する。しかし、Ｘ１７−１８疑似プロリンジペプチドを、ＧＬＰ−１（７−３６）の１７及び１８の位置に対応する位置において成長鎖に加える（天然Ｓｅｒ残基の対を１７及び１８の位置に連続的に加える代わりに）。ペプチド中間体フラグメントの合成は、Ｎ末端残基の後で完結している（例えば、Ｎ末端スレオニン残基（Ｔ）が新生ペプチド鎖に加えられている）。]
[0095] フラグメント３は、配列番号２３：




（式中、Ｘ３５は、上に定義する通りである）のアミノ酸残基を含むペプチドフラグメント、又はその対応物、又はＸ３５残基を含むその対応物である。アミノ酸残基の１つ又は複数は、従来の実行に従い、側鎖保護基を含んでよい。フラグメント３は、天然ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドの２３から３５の位置におけるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を含む（Ｘ３５が、３５の位置の天然アミノ酸残基の代わりにその位置にあることを除く）。フラグメント３は、表示（Ｘ３５）ＧＬＰ−１（２３−３５）により表わしてよい。]
[0096] 一部の実施態様において、ペプチドフラグメント３は、Ｃ末端を介して結合された樹脂でよい。このフラグメントは、場合により、側鎖、Ｎ末端及び／又はＣ末端保護基を持ちうる。Ｆｍｏｃは、ペプチドフラグメントの固相合成に関して特に有用なＮ末端保護基であることが見出されている。]
[0097] 好ましい実施態様において、Ｘ３５は配列番号２４：




のＡｉｂであるか、又は３５の位置にＡｉｂを含むその対応物である。配列番号１０のペプチドフラグメントは、表示（Ａｉｂ３５）ＧＬＰ−１（２３−３５）により表わしてよく、天然ＧＬＰ−１（７−３６）の３５の位置の天然アミノ酸におけるＡｉｂでの置換を記載する。]
[0098] 配列番号２３及び２４のフラグメント３が、Ｃ末端の３６の位置においてＲ（Ａｒｇ）残基をまだ含まないことに留意すること。Ａｒｇは、後に、溶液相中で、好ましくは側鎖保護を伴わないＡｒｇを使用して、フラグメント３のＣ末端に結合される。この戦略は、スキーム１内で有意な利点を提供する。なぜなら、それは、保護Ａｒｇの使用の結果として生じる傾向のある望ましくない副反応を回避するからである。例えば、保護Ａｒｇの脱保護時、脱保護の副産物は、ペプチドの他の構成物（例、トリプトファン）と反応する傾向がありうる。これによって、精製のための粗精製物中で利用可能な所望のペプチドの量が低下する。]
[0099] 固相合成は、一般的に、フラグメント３のＣ末端からＮ末端の方向で行われる。このように、Ｘ３５アミノ酸は、フラグメントのＣ末端部分に存在し、固相樹脂支持体に結合される第１のアミノ酸残基である。固相合成は、次に、所望の配列に対応する様態でアミノ酸残基を連続的に加えることにより進行する。ペプチド中間体フラグメントの合成は、Ｎ末端残基の後で完結している（例えば、Ｎ末端グルタミン残基（Ｑ）が新生ペプチド鎖に加えられている）。フラグメント３の合成において使用されるアミノ酸のいずれも、従来の実行に従って、側鎖保護を含みうる。]
[0100] Ｘ３５添加支持体樹脂に近接した立体障害のため、リジン（３４）及びバリン（３３）の成長ペプチド鎖上への結合が問題になりうる。過剰のアミノ酸を用いても、これらの結合反応を強制的に完結させることは困難である。溶媒選び及び／又はエンドキャッピングは、この問題を軽減する助けとなりうる。結合溶媒の性質が、結合が完結する程度に影響を及ぼしうることが見出されている。一組の実験において、例えば、結合反応は３：１ ＮＭＰ／ＤＣＭ、１：１ ＮＭＰ／ＤＣＭ、１：１ＤＭＦ／ＤＣＭ、及び３：１ ＤＭＦ／ＤＣＭにおいて行われた。これらの溶媒の組み合わせにおける比率は、容積ベースである。ＮＭＰはＮ−メチルピロリドンを指し、ＤＣＭはジクロロメタンを指し、そしてＤＭＦはジメチルホルムアミドを指す。結合反応は、１：１ ＤＭＦ／ＤＣＭを使用した場合、さらに先に完結まで進行することが見出された。]
[0101] リジン及びバリンの各々の結合後のエンドキャッピングを使用して、未反応の樹脂支持材料がさらなる結合反応において進行することを防ぐこともできる。エンドキャップされた材料は、精製中に必要に応じて、より簡単に除去される。従来のエンドキャッピング技術を使用してよい。]
[0102] 継続してスキーム１を参照し、フラグメント１、２及び３を、Ａｒｇと共に組み立てて、所望のペプチドを完成させる。]
[0103] スキーム１は、Ａｒｇをフラグメント３のＣ末端に溶液相中で加えて、中間体フラグメント３’を産生することを示す。好ましくは、この方法でペプチドフラグメントに加えられたＡｒｇは、側鎖保護を含まない。フラグメント２を次にフラグメント３’に加えて、配列番号２５のアミノ酸残基を組み入れるより大きな中間体フラグメントを産生し、ここで１７及び１８の位置のＳｅｒ−Ｓｅｒが、依然として、保護された疑似プロリン形状：




（式中、Ｘ３５を上に定義した通りであり、好ましくはＡｉｂであり、そしてＸ１７−１８は上に定義する疑似プロリンジペプチド残基である）にある。中間体フラグメントを表示（Ｘ１７−１８、Ｘ３５）ＧＬＰ−１（１１−３６）により命名してよい。アミノ酸が側鎖保護を持つ範囲では、この保護は望ましくはこの工程を通じて維持される。]
[0104] スキーム１はさらに、そのフラグメント１を次にこの中間体フラグメントに溶液中で加えて、所望のペプチド（配列番号２６）：




を産生する。]
[0105] 代わりの好ましい実施態様では、本発明は、以下の式を有する合成（Ｘ８、Ｘ１０、Ｘ３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチド（配列番号１９）：




（式中、位置８、１０及び３５の記号Ｘの各々は、非依存的に、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基を表示する）及びその対応物を合成するための方法論を提供する。Ｘ８、Ｘ１０及び／又はＸ３５残基のいずれも、場合により、側鎖保護基を含みうる。この式のペプチドは、少なくとも、アキラル、場合により、立体障害されたＸ８及びＸ３５残基が、位置８及び３５で、天然アミノ酸残基で置換されている点で、天然ＧＬＰ−１（７−３６）とは異なる。Ｘ１０残基は、天然アキラルグリシン又は別のアキラルアミノ酸に由来しうる。アキラルＸ８、Ｘ１０及びＸ３５アミノ酸の使用によって、結果として生じるペプチドの安定化が助けられるだけでなく、構築要素としてのこれらのアミノ酸の使用によって、スキーム１において示され、以下でさらに記載される本発明の容易な合成経路を促進することも発見されている。]
[0106] 本発明の原理に従って合成されうる（Ｘ８、Ｘ１０、Ｘ３５）ＧＬＰ−１１（７−３６）ペプチドの特に好ましい実施態様は、式（配列番号１２）：




（好ましくは（示す通り）Ｃ末端がアミド化されている）のペプチド及びその対応物を含む。このペプチドでは、アルファ−アミノイソ酪酸（模式的に略語Ａｉｂにより示す）のアキラル残基をＸ８及びＸ３５の両方として使用し、好ましくはＣ末端にアミドを有し、１０の位置に天然Ｇの残基を使用し、式（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２により命名してよい。この表示は、アミノ酸「Ａｉｂ」に対応するアミノ酸残基が、８及び３５の位置で天然アラニンの代わりに現れることを示す。アキラルアルファ−アミノイソ酪酸はまたメチルアラニンとして公知である。配列番号４のペプチドがＥＰ １１３７６６７ Ｂ１において記載されている。８及び３５の位置でのＡｉｂ残基の存在によって、身体における代謝的分解が減速し、このペプチドを、身体において、天然ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドよりもずっと安定にする。]
[0107] スキーム２において示す合成では、ペプチド産物を調製するための固相及び溶液相技術の組み合わせを使用する。]
[0108] ]
[0109] 示す通り、スキーム２は、ペプチド中間体フラグメント１＋２、及び３を固相上で合成することを含む。フラグメント１＋２は、配列番号２７：




（式中、Ｘ８及びＸ１０は上に定義する通りである）のアミノ酸残基を含むペプチドフラグメントであるか、又はＸ８及びＸ１０残基を含むその対応物である。アミノ酸残基の１つ又は複数は、従来の実行に従い、側鎖保護基を含んでよい。一部の実施態様において、ペプチドフラグメント１２は、Ｃ末端を介して結合された樹脂でよい。このフラグメントは、場合により、Ｎ末端及び／又はＣ末端保護基を持ちうる。Ｆｍｏｃは、ペプチドフラグメントの固相合成及び溶液相又は固相結合に関して特に有用なＮ末端ヒスチジン保護基であることが見出されている。Ｔｒｔ（トリチル）も、ペプチドフラグメントの固相合成及び溶液相又は固相結合に関して特に有用なＮ末端ヒスチジン保護基であることが見出されている。Ｂｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）、ＣＢｚ（ベンジルオキシカルボニル又はＺ）、Ｄｔｓ（ジチアスクシノイル（dithiasuccinoyl））、Ｒｄｔｃ（Ｒ＝アルキル又はアリール、ｄｔｃ＝ジチオカルバメート）、ＤＢＦｍｏｃ（２，７−ジ−ｔ−ブチルＦｍｏｃ又は１，７−ジ−ｔ−ブチルフルオレン−９−イルメトキシカルボニル）、Ａｌｌｏｃ（アリルオキシカルボニル）、ｐＮＺ（ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル）、Ｎｓｃ（［［２−［（４−ニトロフェニル）スルホニル］エトキシ］カルボニル］）、Ｍｓｃ（２−メチルスルホニルエトキシカルボニル）、及びＭＢｚ（４−メトキシＣＢｚ）も、ペプチドフラグメントの固相合成及び溶液相又は固相結合に関して特に有用なＮ末端ヒスチジン保護基である。Ｂｐｏｃ［（１−［１，１’−ビフェニル］−４−イル−１−メチルエトキシ）カルボニル］、Ｂｎｐｅｏｃ［［２，２−ビス（４−ニトロフェニル）エトキシ］カルボニル］、ＣＢｚ［（フェニルメトキシ）カルボニル］、Ａｏｃ［（１，１−ジメチルプロポキシ）カルボニル］、及びＭｏｚ［［（４−メトキシフェニル）メトキシ］カルボニル］は、ペプチドフラグメントの固相合成及び溶液相又は固相結合に関して特に有用なＮ末端ヒスチジン保護基である。]
[0110] フラグメント１＋２は、天然ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドの７から２７の位置におけるアミノ酸に対応する２０個のアミノ酸残基を含み、従って、表示（Ｘ８、Ｘ１０、Ｘ１７−１８）ＧＬＰ−１（７−２７）により表わしてよい。好ましい実施態様において、Ｘ８はＡｉｂであり、Ｘ１０は配列番号２８：




のグリシンである。
又は１０の位置にＡｉｂ残基を含むその対応物である。配列番号２８のペプチドフラグメントは、表示（Ａｉｂ８、Ｘ１７−１８）ＧＬＰ−１（７−２７）により表わしてよく、天然ＧＬＰ−１（７−３６）の８の位置の天然アラニンにおけるＡｉｂでの置換を記載する。記号Ｘ１７−１８により表示される残基は、疑似プロリンのジペプチド残基（以下でさらに定義する）、又は１７及び１８の位置にＸ１７−１８を含むその対応物である。]
[0111] フラグメント２は、天然ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドの１１から２７の位置におけるアミノ酸残基に一般的に対応するアミノ酸残基を含む（疑似プロリンジペプチド残基Ｘ１７−１８が、天然ＧＬＰ−１（７−３６）の対応する１７及び１８位置を占めるＳＳ（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）残基の代わりに使用されることを除く）。]
[0112] フラグメント２のアミノ酸残基の１つ又は複数は、従来の実行に従い、側鎖保護基を含んでよい。一部の実施態様において、ペプチドフラグメント２は、Ｃ末端を介して結合された樹脂でよい。このフラグメントは、場合により、Ｎ末端及び／又はＣ末端保護基を持ちうる。Ｆｍｏｃは、ペプチドフラグメントの固相合成に関して特に有用なＮ末端保護基であることが見出されている。配列番号２９




のペプチドフラグメント２は、表示（Ｘ１７−１８）ＧＬＰ−１（１１−２７）により呼んでよく、１７及び１８の位置のＳｅｒ−Ｓｅｒ残基についてＸ１７−１８疑似プロリン残基での置換を記載する。]
[0113] 本発明の実行において使用する疑似プロリンという用語は、ヒドロキシル機能的アミノ酸の残基（例えばＳｅｒ又はＴｈｒなど）を含むジペプチドを指し、ここでヒドロキシル機能的側鎖は、アルファ−アミノと側鎖ヒドロキシルの間のプロリン様ＴＦＡ不安定オキサゾリジン環として保護される。オキサゾリジン環の結果として、ジペプチドは可逆的プロリン模倣体として機能する。]
[0114] フラグメント１＋２の合成における構築要素としてのそのようなプロリン模倣体の使用は、本発明に関連する有意な利点を提供する。第１に、フラグメント２の固相合成が著しく簡単になる。疑似プロリンがフラグメント２の固相合成の過程において使用されない場合、残基１３から１１までのＦｍｏｃ除去に有意な問題が存在しうる。この困難はベータシート形成に起因しうると考えられる。疑似プロリンの使用によって、これらのＦｍｏｃ除去が、恐らくはベータシート形成の程度を低下させることにより、ずっと簡単になる。疑似プロリン残基の非存在では、典型的な溶液相結合溶媒中でのフラグメントの溶解度は非常に悪い。疑似プロリンは、フラグメント２（及びフラグメント２、例えばフラグメント１＋２などを組み入れるより長いフラグメント）の溶解度の特徴を増強し、フラグメント１＋２の後の溶液相結合を簡単にする。]
[0115] 固相合成は、一般的に、フラグメント１＋２のＣ末端からＮ末端の方向で行われる。このように、Ｅ２７アミノ酸は、フラグメントのＣ末端部分に存在し、固相樹脂支持体に結合される第１のアミノ酸残基である。固相合成は、次に、所望の配列に対応する様態でアミノ酸残基を連続的に加えることにより進行する。しかし、Ｘ１７−１８疑似プロリンジペプチドを、ＧＬＰ−１（７−３６）の１７及び１８の位置に対応する位置において成長鎖に加える（天然Ｓｅｒ残基の対を１７及び１８の位置に連続的に加える代わりに）。ペプチド中間体フラグメントの合成は、Ｎ末端残基の後で完結している（例えば、Ｎ末端スレオニン残基（Ｔ）が新生ペプチド鎖に加えられている）。]
[0116] フラグメント３は、配列番号３０：




（式中、Ｘ３５は、上に定義する通りである）のアミノ酸残基を含むペプチドフラグメント、又はその対応物であるか、又はＸ３５残基を含むその対応物である。アミノ酸残基の１つ又は複数は、従来の実行に従い、側鎖保護基を含んでよい。フラグメント３は、天然ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドの２８から３５の位置におけるアミノ酸に対応するアミノ酸残基を含む（Ｘ３５が、３５の位置の天然アミノ酸残基の代わりにその位置にあることを除く）。配列番号３０のフラグメント３は、表示（Ｘ３５）ＧＬＰ−１（２８−３５）により表わしてよい。]
[0117] 一部の実施態様において、ペプチドフラグメント３は、Ｃ末端を介して結合された樹脂でよい。このフラグメントは、場合により、側鎖、Ｎ末端及び／又はＣ末端保護基を持ちうる。Ｆｍｏｃは、ペプチドフラグメントの固相合成に関して特に有用なＮ末端保護基であることが見出されている。]
[0118] 好ましい実施態様において、Ｘ３５は配列番号３１：




のＡｉｂである。
又は３５の位置にＡｉｂを含むその対応物である。配列番号３１のペプチドフラグメントは、表示（Ａｉｂ３５）ＧＬＰ−１（２８−３５）により表わしてよく、天然ＧＬＰ−１（７−３６）の３５の位置の天然アミノ酸におけるＡｉｂでの置換を記載する。]
[0119] 配列番号３０及び３１のフラグメント３が、Ｃ末端の３６の位置においてＲ（Ａｒｇ）残基をまだ含まないことに留意すること。Ａｒｇは、後に、溶液相中で、好ましくは側鎖保護を伴わないＡｒｇを使用して、フラグメント３のＣ末端に結合される。この戦略は、スキーム２内で有意な利点を提供する。なぜなら、それは、保護Ａｒｇの使用の結果として生じる傾向のある望ましくない副反応を回避するからである。例えば、保護Ａｒｇの脱保護時、脱保護の副産物は、ペプチドの他の構成物（例、トリプトファン）と反応する傾向がありうる。これによって、精製のための粗精製物中で利用可能な所望のペプチドの量が低下する。]
[0120] 配列番号３２：




（式中、Ｘ３５は上に定義する通りである）のフラグメント３’は、配列番号３２のアミノ酸残基を含むペプチドフラグメント、又はその対応物であるか、又はＸ３５残基を含むその対応物である。アミノ酸残基の１つ又は複数は、従来の実行に従い、側鎖保護基を含んでよい。フラグメント３’は、天然ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドの２８から３６の位置におけるアミノ酸に対応するアミノ酸残基を含む（Ｘ３５が、３５の位置の天然アミノ酸残基の代わりにその位置にあることを除く）。配列番号３２のフラグメント３’は、表示（Ｘ３５）ＧＬＰ−１（２８−３６）により表わしてよい。]
[0121] 固相合成は、一般的に、フラグメント３のＣ末端からＮ末端の方向で行われる。このように、Ｘ３５アミノ酸は、フラグメントのＣ末端部分に存在し、固相樹脂支持体に結合される第１のアミノ酸残基である。固相合成は、次に、所望の配列に対応する様態でアミノ酸残基を連続的に加えることにより進行する。ペプチド中間体フラグメントの合成は、Ｎ末端残基の後で完結している（例えば、Ｎ末端グルタミン残基（Ｑ）が新生ペプチド鎖に加えられている）。フラグメント３の合成において使用されるアミノ酸のいずれも、従来の実行に従って、側鎖保護を含みうる。]
[0122] Ｘ３５添加支持体樹脂に近接した立体障害のため、リジン（３４）及びバリン（３３）の成長ペプチド鎖上への結合が問題になりうる。過剰のアミノ酸を用いてでさえ、これらの結合反応を強制的に完結させることは困難である。溶媒選び及び／又はエンドキャッピングは、この問題を軽減する助けとなりうる。結合溶媒の性質が、結合が完結する程度に影響を及ぼしうることが見出されている。一組の実験において、例えば、結合反応は３：１ ＮＭＰ／ＤＣＭ、１：１ ＮＭＰ／ＤＣＭ、１：１ＤＭＦ／ＤＣＭ、及び３：１ ＤＭＦ／ＤＣＭにおいて行われた。これらの溶媒の組み合わせにおける比率は、容積ベースである。ＮＭＰはＮ−メチルピロリドンを指し、ＤＣＭはジクロロメタンを指し、そしてＤＭＦはジメチルホルムアミドを指す。結合反応は、１：１ ＤＭＦ／ＤＣＭを使用した場合、さらに先に完結まで進行することが見出された。]
[0123] リジン及びバリンの各々の結合後のエンドキャッピングを使用して、未反応の樹脂支持材料がさらなる結合反応において進行することを防ぐこともできる。エンドキャップされた材料は、精製中に必要に応じて、より簡単に除去される。従来のエンドキャッピング技術を使用してよい。]
[0124] 継続してスキーム２を参照し、フラグメント１、２及び３を、Ａｒｇと共に組み立てて、所望のペプチドを完成させる。]
[0125] スキーム２は、Ａｒｇをフラグメント３のＣ末端に溶液相中で加えて、配列番号３２




（式中、Ｘ３５は上に定義する通りであり、好ましくはＡｉｂである）の中間体フラグメント３’を産生することを示す。好ましくは、この方法でペプチドフラグメントに加えられたＡｒｇは、側鎖保護を含まない。]
[0126] フラグメント１＋２は、それにおいて１７及び１８の位置のＳｅｒ−Ｓｅｒが、依然として、保護された疑似プロリン形状（配列番号２７）：




であり、表示（Ｘ１７−１８、Ｘ３５）ＧＬＰ−１（１１−３６）により命名され、次にフラグメント３’に溶液相中で結合させる。他のアミノ酸が側鎖保護を持つ範囲で、この保護は望ましくはこの工程を通じて維持される。フラグメント１＋２＋３を組み入れる、配列番号２６：




の所望のペプチドを次に形成させて、式中、好ましい実施態様において、Ｘ８はＡｉｂであり、Ｘ１０は天然Ｇであり、そしてＸ１７−１８は上に定義する疑似プロリンジペプチド残基である。]
[0127] スキーム１及び２の反応スキームを行う際、固相及び溶液相合成は、工業において公知の標準的方法により行ってよい。代表的な実行方法において、ペプチドは固相中で、アミノ酸をＣ末端からＮ末端に付加する化学反応を使用して合成する。このように、特定のフラグメントのＣ末端に近接したアミノ酸基又はペプチド基が、樹脂に付加される第１のものである。これは、アミノ酸基又はペプチド基のＣ末端の官能性を、樹脂支持体上の相補的な官能性と反応させることにより生じる。アミノ酸基又はペプチド基のＮ末端側をマスクして、望ましくない副反応を防ぐ。アミノ酸基又はペプチド基は、望ましくは、側鎖保護も含む。次に、連続アミノ酸基又はペプチド基を、支持体結合ペプチド材料に、目的のペプチドが形成されるまで付着させる。これらの大半が、従来の実行に従って側鎖保護も含む。各々の連続結合を用いて、樹脂結合ペプチド材料のＮ末端のマスキング基を除去する。これを次に、Ｎ末端がマスクされた次のアミノ酸のＣ末端と反応させる。固相合成の産物は、このように、樹脂支持体に結合したペプチドである。]
[0128] フラグメントの質の差異（例えば、残留溶媒の量、残留ジベンゾフルベン、又はアッセイもしくは質における変異）の影響を最小限にするために、概念は、算出のための基礎として各フラグメントの全ペプチドアッセイを使用することであった。フラグメント２のペプチド性不純物の大半は、多かれ少なかれフラグメント２と同じ重量を有し、フラグメント２として反応し、そして、フラグメント３’のペプチド性不純物の大半は、多かれ少なかれフラグメント３’と同じ重量を有し、フラグメント３’として反応するため、全ペプチドの概念によって反応物の比率を調整することが可能になる。算出の目的のために、ジベンゾフルベンは一般的に考慮されない。なぜなら、それはペプチドではなく、質量に関して、そのＵＶシグナルにより大量に過大評価されるからである（フラグメントと同じ応答係数）。このように、フラグメントの全ペプチドアッセイを以下の通りに算出することができる：
ａ）アッセイ（%−mm）＊（１００−ジベンゾフルベンの量（%面積））／［質（%面積）］又は
ｂ）主成分及び全てのペプチド性不純物の合計（%−（w/w））−ジベンゾフルベン（%−（mm））（ペプチドと同じ応答係数）。]
[0129] 固相ペプチド合成の実行において適した任意の型の支持体を使用することができる。好ましい実施態様において、支持体は、１つ又は複数のポリマー、コポリマー、又はポリマー（例えばポリアミド、ポリスルファミド、置換ポリエチレン、ポリエチレングリコール、フェノール樹脂、ポリサッカライド、又はポリスチレンなど）の組み合わせから作ることのできる樹脂を含む。ポリマー支持体は、また、ペプチド合成において使用される溶媒に十分に不溶性及び不活性である任意の固体でありうる。固体支持体は、典型的に、成長ペプチドを合成中に結合し、そして、所望の条件下で切断し、ペプチドを支持体から放出させることができる連結成分を含む。適した固体支持体は、光切断可能、ＴＦＡ切断可能、ＨＦ切断可能、フッ化物イオン切断可能、還元切断可能；Ｐｄ（Ｏ）切断可能；求核切断可能；又はラジカル切断可能なリンカーを有しうる。好ましい連結成分は、切断ペプチドの側鎖基が依然として実質的に、全体的に保護される条件下で切断可能である。]
[0130] １つの好ましい合成方法において、ペプチド中間体フラグメントは、トリチル基を含む酸感受性の固体支持体上で、より好ましくは、ペンダント塩素基を有するトリチル基を含む樹脂（例えば、２−クロロトリチルクロリド（２−ＣＴＣ）樹脂）上で合成される（Barlos et al. (1989) Tetrahedron Letters 30(30): 3943-3946）。例は、また、トリチルクロリド樹脂、４−メチルトリチルクロリド樹脂、４−メトキシトリチルクロリド樹脂、４−アミノブタン−１−オール２−クロロトリチル樹脂、４−アミノメチルベンゾイル２−クロロトリチル樹脂、３−アミノプロパン−１−オール２−クロロトリチル樹脂、ブロモ酢酸２−クロロトリチル樹脂、シアン酢酸２−クロロトリチル樹脂、４−シアノ安息香酸２−クロロトリチル樹脂、グリシノール２−クロロトリチル樹脂、プロピオン酸２−クロロトリチル樹脂、エチレングリコール２−クロロトリチル樹脂、Ｎ−Ｆｍｏｃヒドロキシルアミン２−クロロトリチル樹脂、ヒドラジン２−クロロトリチル樹脂を含む。一部の好ましい固体支持体は、ポリスチレンを含み、それはジビニルベンゼンを用いてコポリマー化させて、反応基を固定させた支持体材料を形成することができる。]
[0131] 固相合成において使用される他の樹脂は、「Ｗａｎｇ」樹脂（４−ヒドロキシメチルフェニルオキシメチル固定基を伴うスチレン及びジビニルベンゼンのコポリマーを含む）（Wang, S. S. 1973, J. Am. Chem. Soc.）、及び４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸樹脂（Richter et al. (1994), Tetrahedron Letters 35(27): 4705-4706）を含む。Ｗａｎｇ、２−クロロトリチルクロリド、及び４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸樹脂は、例えば、Calbiochem-Novabiochem Corp.（San Diego, California）から購入することができる。]
[0132] 固相合成のための樹脂を調製するために、樹脂を適した溶媒中で予洗することができる。例えば、固相樹脂（例えば２−ＣＴＣ樹脂など）を、ペプチドチェンバーに加えて、適した溶媒を用いて予洗する。予洗溶媒を、結合反応において使用される溶媒（又は溶媒の混合物）の型に基づいて選んでよく、又は逆も同様である。洗浄、及びまた後の結合反応のために適した溶媒は、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、ジクロロエタン（ＤＣＥ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、及び同様のもの、ならびにこれらの試薬の混合物を含む。他の有用な溶媒は、ＤＭＳＯ、ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、Ｎ−メチルピロリドン、及びその混合物を含む。一部の場合において、結合はバイナリー溶媒系、例えばＤＭＦ及びＤＣＭの混合物（容積比率９：１〜１：９の範囲、より共通して４：１〜１：４）などにおいて行うことができる。]
[0133] 本発明の合成は、好ましくは、特に記載のない場合、適切な保護基の存在において行う。保護基の性質及び使用は、当技術分野において周知である。一般的に、適した保護基は、それが付着する原子又は成分（例、酸素又は窒素）が、プロセシング及び合成中に望ましくない反応に関与することを防ぐことを助けうる任意の種類の基である。保護基は、側鎖保護基及びアミノ保護基又はＮ末端保護基を含む。保護基は、また、カルボン酸、チオール、及び同様のものの反応又は結合を防ぐことができる。]
[0134] 側鎖保護基は、側鎖の部分がペプチド合成、プロセシングなどの工程において使用される化学物質と反応することを防ぐことを助けるアミノ酸の側鎖（即ち、一般的なアミノ酸化学式Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｒ）（Ｈ）−ＣＯＯＨ中のＲ基）に結合した化学部分を指す。側鎖保護基の選択は、種々の要素、例えば、実施される合成の型、ペプチドが供されるプロセシング、及び所望の中間産物又は最終産物に依存しうる。側鎖保護基の性質は、アミノ酸自体の性質にも依存する。一般的に、固相合成中でのα−アミノ基の脱保護中に除去されない側鎖保護基が選ばれる。従って、α−アミノ保護基及び側鎖保護基は典型的に同じではない。]
[0135] 一部の場合において、ならびに固相合成及び他のペプチドプロセシングにおいて使用される試薬の型に依存して、アミノ酸は側鎖保護基の存在を要求しないことがある。そのようなアミノ酸は、典型的に、反応性酸素、窒素、又は他の反応性部分を側鎖中に含まない。]
[0136] 側鎖保護基の例は、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ｔｅｒｔ−ブチル、トリフェニルメチル（トリチル）、テトラヒドロピラニル、ベンジルエーテル（Ｂｚｌ）及び２，６−ジクロロベンジル（ＤＣＢ）、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ニトロ、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）、アダマンチルオキシカルボニル、キサンチル（Ｘａｎ）、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、メチル、エチル及びｔ−ブチルエステル、ベンジルオキシカルボニル（ｃＢｚ又はＺ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−Ｃ１−Ｚ）、ｔ−アミルオキシカルボニル（Ａｏｃ）、及び芳香族又は脂肪族ウレタン型保護基、光不安定基、例えばニトロ−ベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）など；及びフッ化物不安定基、例えば２−トリメチルシリルエトキシカルボニル（ＴＥＯＣ）などを含む。]
[0137] 本発明の実行においてＧＬＰ−１ペプチドを合成するために共通して使用されるアミノ酸のための好ましい側鎖保護基を、以下の表Ａにおいて示す：]
[0138] ]
[0139] アミノ末端保護基は、アミノ酸のアルファアミノ基に結合した化学部分を含む。典型的に、アミノ末端保護基は、成長ペプチド鎖に加えられるべき次のアミノ酸の添加前での脱保護反応中に除去されるが、しかし、ペプチドが支持体から切断される際に維持させることができる。アミノ末端保護基の選択は、種々の要素、例えば、実施される合成の型及び所望の中間産物又は最終産物に依存しうる。]
[0140] アミノ末端保護基の例は、（１）アシル型保護基、例えばホルミル、アクリリル（Ａｃｒ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、及びアセチル（Ａｃ）；（２）芳香族ウレタン型保護基、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｚ）及び置換Ｚなど、例えばｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニルなど；（３）脂肪族ウレタン保護基、例えばｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、アリルオキシカルボニルなど；（４）シクロアルキルウレタン型保護基、例えば９−フルオレニル−メチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、及びシクロヘキシルオキシカルボニルなど；及び（５）チオウレタン型保護基、例えばフェニルチオカルボニルなどを含む。好ましい保護基は、９−フルオレニル−メチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、２−（４−ビフェニリル）−プロピル（２）オキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、２−フェニルプロピル（２）−オキシカルボニル（Ｐｏｃ）、及びｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）を含む。]
[0141] Ｆｍｏｃ又はＦｍｏｃ様化学は、固相ペプチド合成のために高度に好ましい（結果として生じるペプチドの保護された状態での切断を、比較的容易に弱酸性の切断剤を使用して行えるからである）。この種類の切断反応は、結果として生じる副産物、不純物などに関して比較的清浄であり、ペプチドを大規模ベースで膨潤及び収縮洗浄の両方から回収することを技術的及び経済的に実行可能にして、収率を増強する。本明細書において使用する、ペプチド合成に関する「大規模」は、一般的に、少なくとも５００g、より好ましくは少なくとも２kg/バッチの範囲のペプチド合成を含む。大規模合成は、典型的に、大きな反応容器、例えば鉄製反応容器など（試薬、例えば樹脂、溶媒、アミノ酸、結合及び脱保護反応のための化学物質などの分量を収容することができ、キログラムからメートルトンの範囲でのペプチド産生を可能にするサイズになっている）において実施される。]
[0142] また、Ｆｍｏｃ保護基は、側鎖保護基と比べて、ペプチドから選択的に切断することができ、側鎖保護が、Ｆｍｏｃ切断時にその場に残される。この種類の選択性は、側鎖反応を最小限にするためにアミノ酸結合中に重要である。また、側鎖保護基を選択的に切断して、Ｆｍｏｃと比べてそれらを除去して、Ｆｍｏｃをその場所に残すことができる。この後者の選択性は、非常に有利なことに、以下でさらに記載する精製スキーム中で信頼される。]
[0143] 固相結合反応を、結合反応を増強又は改善する１つ又は複数の化合物の存在において実施することができる。反応の速度を増加させ、副反応の速度を低下させることができる化合物は、ホスホニウム塩及びウロニウム塩を含み、それらは、第３級塩基（例えば、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）及びトリエチルアミン（ＴＥＡ））の存在において、保護アミノ酸を活性種（例えば、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＨＢＴＵ、及びＴＢＴＵ（ＨＯＢｔエステルを生成する）及びＤＥＰＢＴ（ＨＯＯＢｔエステルを生成する））に変換することができる。他の試薬は、保護試薬を提供することによりラセミ化を防ぐことを助ける。これらの試薬は、加えられた補助求核剤（例えば、１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、又はＨＯＳｕ）を伴うカルボジイミド（例えば、ＤＣＣ又はＷＳＣＤＩ）を含む。混合酸無水物法（クロロギ酸イソブチルを使用し、補助求核剤を加えて又は加えず）も、アジド法で可能なように、それに関連する低ラセミ化のため、利用してよい。これらの型の化合物も、カルボジイミド媒介性結合の速度を増加させ、ならびにＡｓｎ及びＧｌｎ残基の脱水を防ぐことができる。]
[0144] 結合が完結したことを判断した後、結合反応混合物を、溶媒を用いて洗浄し、結合サイクルを、ペプチド材料の後のアミノ酸残基の各々について繰り返す。次のアミノ酸を結合させるために、樹脂結合材料からのＮ末端保護基（例えば、Ｆｍｏｃ基）の除去は、典型的に、２０〜５０%（重量ベース）のピペリジンを溶媒（例えばＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）又はジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）など）中に含む試薬を用いた処理により達成される。Ｆｍｏｃ保護基の除去後、数回の洗浄を典型的に実施して、残留ピペリジン及びＦｍｏｃ副産物（例えばジベンゾフルベン及びそのピペリジン付加体など）を除去する。]
[0145] 後のアミノ酸を、樹脂支持体上のペプチド材料の添加係数に関して、化学量論的に過剰のアミノ酸で利用することができる。一般的に、結合工程において使用されるアミノ酸の量は、樹脂上の第１のアミノ酸の添加係数と少なくとも等しい（１当量又はそれ以上）。好ましくは、結合工程において使用されるアミノ酸の量は、少なくとも１．３当量（０．３過剰）又はそれ以上、最も好ましくは約１．５当量（０．５過剰）又はそれ以上である。一部の場合において、例えば、結合工程は、１〜３の範囲のアミノ酸と等しい量を利用する。]
[0146] 最終結合サイクルに続き、樹脂を、溶媒（例えばＮＭＰなど）を用いて洗浄し、そして次に不活性な第２溶媒（例えばＤＣＭなど）を用いて洗浄する。合成されたペプチド材料を樹脂から除去するために、切断処理を、切断されたペプチド材料が依然として十分な側鎖基及び末端保護基を持つような様態で行う。保護基をその場所に残すことによって、樹脂切断中又は後でのペプチドフラグメントの望ましくない結合又は他の望ましくない反応を防ぐ助けとなる。Ｆｍｏｃ又は類似の化学反応を使用し、ペプチドを合成する場合において、保護された切断は、任意の所望の様式、例えば、比較的弱酸性の試薬（例えば酢酸又は希釈ＴＦＡなど）の溶媒（例えばＤＣＭなど）中での使用などにより達成してよい。０．５〜１０重量％、好ましくは１〜３重量％のＴＦＡのＤＣＭ中での使用が典型的である。例えば、米国特許第６，２８１，３３５号を参照のこと。]
[0147] ペプチド中間体フラグメントを固相樹脂から切断する工程は、例示のプロセスのラインに沿って進行することができ、以下の通りである。しかし、ペプチド中間体フラグメントを樹脂から効率的に切断する任意の適したプロセスを使用することができる。例えば、約５〜２０、好ましくは約１０容積の酸性切断試薬を含む溶媒を、樹脂結合ペプチド材料を含む容器に加える。樹脂は、典型的に、ビーズの形状であり、結果として試薬中に浸す。切断反応は、液体内容物を適した温度で適した時間にわたり撹拌する際に生じる。撹拌によってビーズが凝集することを防ぐ助けとなる。適した時間及び温度条件は、要素、例えば使用される酸性試薬、ペプチドの性質、樹脂の性質、及び同様のものなどに依存する。一般的なガイドラインとして、約−１５℃〜約５℃、好ましくは約−１０℃〜約０℃で約５分間〜２時間、好ましくは約２５分間〜約４５分間の撹拌が適しうる。切断時間は、約１０分間〜約２時間の範囲、又はさらに１日でありうる。切断は、望ましくは、そのような冷却温度の範囲において行われ、典型的に反応中に生じうる発熱反応に順応させる。また、切断反応のより低い温度によって、酸感受性の側鎖保護基（例えばｔｒｔ基など）のこの段階での除去が防がれる。]
[0148] 切断処理の終了時、反応をクエンチする。これは、例えば、切断試薬を適した塩基（例えばピリジン又は同様のものなど）と組み合わせ、かき混ぜ及び撹拌を追加期間、例えば追加の５分間〜２時間など、好ましくは約２０分間〜約４０分間にわたり継続することにより達成してよい。塩基を加えて、撹拌を継続することによって、容器の内容物の温度が増加する。撹拌の終了時、容器の内容物は、約０℃〜約１５℃、好ましくは約５℃〜約１０℃の範囲の温度でよい。]
[0149] ペプチド回収の局面を改善するために樹脂を膨潤又は収縮させるなどの要素を、場合により、全合成プロセス中に組み入れることができる。これらの技術は、例えば、米国特許出願公開第２００５／０１６４９１２ Ａ１号において記載されている。]
[0150] 一部の局面において、切断されたペプチドフラグメントを、他のペプチドフラグメント及び／又はアミノ酸への溶液相結合のために調製することができる。溶液相中でのペプチド結合反応は、例えば、New Trendsin Peptide Coupling Reagents；Albericio, Fernando； Chinchilla, Rafeal；Dodsworth, David J.；及びNajera, Armen；Organic Preparations and Procedures International (2003), 33(3), 203-303において概説されている。]
[0151] ペプチド中間体フラグメントの他のフラグメント又はアミノ酸への溶液相中での結合は、ｉｎ ｓｉｔｕ結合試薬、例えば、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホウ酸（ＨＡＴＵ）、ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホスフェート（ＴＡＴＵ）、ｏ−（１Ｈ−６−クロロ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、ｏ−（１Ｈ−６−クロロ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸（ＴＣＴＵ）、ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）オキシビオス（oxybios）−（ピロリジノ）−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＰｙＵ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド、３−（ジエトキシホスホリルオキシ）−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−ワン（ＤＥＰＢＴ）、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣＤＩ）、ｏ−（シアノ−エトキシカルボニル−メチレンアミノ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸（ＴＯＴＵ）、又はｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸（ＴＢＴＵ）を使用して行うことができる。他の結合技術では、事前に形成された活性エステル、例えばヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）及びｐ−ニトロフェノール（ＨＯＮｐ）エステルなど；事前に形成された対称無水物；非対称無水物、例えばＮ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）など；又は酸ハロゲン化物、例えばアシルフッ化物など、ならびにアシルクロリドを使用する。]
[0152] 適した結合溶媒を、溶液相結合反応において使用することができる。使用される結合溶媒が、形成されるペプチド結合のラセミ化の程度；ペプチド及び／又はペプチドフラグメントの溶解度；及び結合反応速度に影響を及ぼしうることが理解される。一部の実施態様において、結合溶媒は、１つ又は複数の水混和性試薬を含む。水混和性溶媒の例は、例えば、ＤＭＳＯ、ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、又はそれらの混合物を含む。]
[0153] 他の実施態様において、結合反応は、１つ又は複数の非水混和性試薬を含んでよい。例示的な非水混和性溶媒は、メチレンクロリドである。これらの実施態様において、非水混和性溶媒は、好ましくは、脱保護反応に適合する；例えば、非水混和性溶媒を使用する場合、好ましくは、それは脱保護反応に悪影響を及ぼさない。]
[0154] 配列番号１０のペプチドが形成された後、産物を、脱保護、精製、凍結乾燥、さらなるプロセシング（例、融合タンパク質を形成するための別のペプチドとの反応）；これらの組み合わせ、及び／又は同様のものに、適宜、供することができる。]
[0155] 例えば、本発明によると、側鎖保護基は、典型的に、固相合成の間中、また、溶液相結合反応へ、及び、それの間中、ペプチド中間体フラグメント上に保持される。一般的に、溶液相工程が完結した後、１つ又は複数の脱保護工程を実施して、１つ又は複数の保護基をペプチドから除去してよい。]
[0156] 全体的な脱保護による側鎖保護基の除去では、典型的に、酸分解剤（acidolytic agent）を含む脱保護溶液を利用して、側鎖保護基を切断する。全体的な脱保護のために共通して使用される酸分解試薬は、ニート（neat）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ＨＣｌ、ルイス酸（例えばＢＦ３Ｅｔ２Ｏ又はＭｅ３ＳｉＢｒなど）、液体フッ化水素酸（ＨＦ）、臭化水素酸（ＨＢｒ）、トリフルオロメタンスルホン酸、及びそれらの組み合わせを含む。脱保護溶液は、また、１つ又は複数の適した陽イオンスカベンジャー、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、アニソール、ｐ−クレゾール、エタンジチオール、又はジメチルスルフィドを含む。脱保護溶液は水も含みうる。本明細書において使用する通り、脱保護組成物中に存在する試薬の量は、典型的に、比率で表わされ、ここで個々の成分の量は、「部」、例えば「重量部」又は「容積部」などの中の分子として表わされ、分母は組成物中の全部分である。例えば、ＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：ＤＴＴを９０：５：５（重量／重量／重量）の比率で含む脱保護溶液は、ＴＦＡを９０／１００重量部で、Ｈ２Ｏを５／１００重量部で、ＤＴＴを５／１００重量部で有する。]
[0157] 析出は、典型的に、エーテル、例えば、ジエチルエーテル又はＭＴＢＥ（メチルタートブチルエーテル）を使用して行われる。析出後、ペプチドは、望ましくは、他の成分と組み合わせる前に単離及び乾燥させ、凍結乾燥し、容器に入れ、保存し、さらにプロセシングし、及び／又は別の方法で取り扱う。これは、任意の適した様式で達成してよい。適したアプローチによると、ペプチドを、ろ過を介して回収し、十分なＭＴＢＥ洗浄液を用いて洗浄し、最終塩含量を適したレベルにまで低下させ、そして次に乾燥させる。]
[0158] 本発明は、また、広範囲のペプチド（ＧＬＰ−１ペプチド及びそれらの対応物を含む）を精製するための有用な技術を提供する。]
[0159] 特に好ましい精製プロセスは、クロマトグラフィー媒体を通じた少なくとも２つの精製通過を含み、ここで少なくとも第１の通過が第１のｐＨで起こり、そして少なくとも第２の通過が第２のｐＨで起こる。より好ましくは、第１の通過は酸性ｐＨで起こり、第２の通過は塩基性ｐＨで起こる。好ましい実施態様において、酸性条件下での少なくとも１つの通過が、塩基性条件下で起こる通過の前に起こる。この精製アプローチを実行する例示的な方法を、完全に保護されたペプチド１１を精製する例示的な状況において記載することができる。最初に、ペプチドは全体的に脱保護される。Ｎ末端基及び側鎖保護基の両方が切断される。第１のクロマトグラフィー通過は、水／ＡＣＮ勾配において、ｐＨ約１〜５、好ましくは約２を提供するために十分なＴＦＡを使用して行われる。第２の通過は、次に、水／ＡＣＮ勾配において、ｐＨ約８〜９前後、好ましくは約８．５〜８．９を提供するために少量のアンモニア及び／又は酢酸アンモニウム、又は同様のものを使用して行われる。]
[0160] ｐＨ値は、酸性又は塩基性を問わず、均一なイオン種が各々の例において存在する点で均一性を促進させる。このように、酸性ｐＨは、望ましくは、十分に低く、ペプチド材料中の実質的に全てのアミノ酸残基がプロトン化される。塩基性ｐＨは、望ましくは、十分に高く、ペプチド材料中の実質的に全てのアミノ酸残基が脱プロトン化される。酸性及び塩基性のクロマトグラフィーは、任意の順番で行うことができる。酢酸ペプチドが所望の産物である場合、塩基性クロマトグラフィーを最後に行うことが便利である（酢酸がクロマトグラフィーの産物でありうるからである）。]
[0161] 共通して使用される略語は以下を含む：アセチル（Ａｃ）、アゾ−ビス−イソブチリルニトリル（ＡＩＢＮ）、雰囲気（Ａｔｍ）、９−ボラビシクロ［３．３．１］ノナン（９−ＢＢＮ又はＢＢＮ）、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルピロカルボネート又はＢｏｃ無水物（ＢＯＣ２Ｏ）、ベンジル（Ｂｎ）、ブチル（Ｂｕ）、Chemical Abstracts Registration Number（ＣＡＳＲＮ）、ベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ又はＺ）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）、ジエチルアミノ硫黄三フッ化物（ＤＡＳＴ）、ジベンジリデンアセトン（ｄｂａ）、１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノン−５−エン（ＤＢＮ）、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１，２−ジクロロエタン（ＤＣＥ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、アゾジカルボン酸ジエチル（ＤＥＡＤ）、（３−（ジエトキシホスホリルオキシ）−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オン）（ＤＥＰＢＴ）、ジ−イソ−アゾジカルボン酸プロピル（ＤＩＡＤ）、ジ−イソ−ブチルアルミニウムヒドリド（ＤＩＢＡＬ又はＤＩＢＡＬ−Ｈ）、ジ−イソ−プロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、エチレングリコールジメチルエーテル（ＤＭＥ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、１，１’−ビス−（ジフェニルホスフィノ）エタン（ｄｐｐｅ）、１，１’−ビス−（ジフェニルホスフィノ）フェロセン（ｄｐｐｆ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣＩ）、エチル（Ｅｔ）、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）、エタノール（ＥｔＯＨ）、２−エトキシ−２Ｈ−キノリン−１−カルボン酸エチルエステル（ＥＥＤＱ）、ジエチルエーテル（Ｅｔ２Ｏ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート酢酸（ＨＡＴＵ）、酢酸（ＨＯＡｃ）、１−Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、イソプロパノール（ＩＰＡ）、リチウムヘキサメチルジシラザン（ＬｉＨＭＤＳ）、メタノール（ＭｅＯＨ）、融点（ｍｐ）、ＭｅＳＯ２−（メシル又はＭｓ）、メチル（Ｍｅ）、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）、ｍ−クロロ過安息香酸（ＭＣＰＢＡ）、質量スペクトル（ｍｓ）、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）、Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）、Ｎ−クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）、Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ピリジニウムクロロクロマート（ＰＣＣ）、ピリジニウムジクロマート（ＰＤＣ）、フェニル（Ｐｈ）、プロピル（Ｐｒ）、イソ‐プロピル（ｉ−Ｐｒ）、ポンド毎平方インチ（ｐｓｉ）、ピリジン（ｐｙｒ），（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、室温（ｒｔ又はＲＴ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル又はｔ−ＢｕＭｅ２Ｓｉ（ＴＢＤＭＳ）、トリエチルアミン（ＴＥＡ又はＥｔ３Ｎ）、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン１−オキシル（ＴＥＭＰＯ）、トリフラート又はＣＦ３ＳＯ２−（Ｔｆ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、１，１’−ビス−２，２，６，６−テトラメチルヘプタン−２，６−ジオン（ＴＭＨＤ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸（ＴＢＴＵ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トリメチルシリル又はＭｅ３Ｓｉ（ＴＭＳ）、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（ＴｓＯＨ又はｐＴｓＯＨ）、４−Ｍｅ−Ｃ６Ｈ４ＳＯ２−又はトシル（Ｔｓ）、Ｎ−ウレタン−Ｎ−カルボキシ無水物（ＵＮＣＡ）。接頭辞ノルマル（ｎ）、イソ（ｉ−）、第二級（sec−）、第三級（tert−）、及びネオを含む従来の命名法は、アルキル部分と使用された場合、それらの慣習的な意味を有する。（J. Rigaudy and D. P. Klesney, Nomenclature in Organic Chemistry, IUPAC 1979 Pergamon Press, Oxford.）。]
[0162] 本発明の原理を、ここで、以下の例示的な実施例に関してさらに説明する。以下において、全てのパーセント及び比率は、別に明確に記載しない場合、容積による。]
[0163] 実施例
実施例１〜１８は、スキーム１において記載される結合反応スキーム及び本明細書におい定義されるフラグメント１、２、３、及び３’に関する。]
[0164] 実施例１
Ｎ末端でのＦｍｏｓ保護、ならびにＨｉｓ及びＧｌｕでの側鎖保護を用いたフラグメント１の固相合成
Ａ．Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−添加２ＣＴＣ樹脂の調製
最初に、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−添加２ＣＴＣ樹脂を調製した。使用された試薬の量を以下の表に列挙する：]
[0165] ]
[0166] ２−ＣＴＣ樹脂を５００mLペプチドリアクターに充填して、４００mLのＤＣＭを用いて３０分間、２５℃で膨潤させた。床を排出させて、８容積のＤＭＦ：ＤＣＭ（８７．５：１２．５）中のＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ及びＤＩＥＡの溶液を加えた。混合物を、窒素下で２時間、温度２５℃で撹拌した。]
[0167] 床を排出させて、３５０mLのＤＭＦで１回そして１７５mLのＤＭＦで１回洗浄した。次に、２−ＣＴＣ樹脂上の残りの活性部位を、３５０mLのＭｅＯＨ：ＤＩＥＡ（９：１）溶液で１時間エンドキャップした。床を排出させて、２５０mLのＤＭＦで２回、そして次に３５０mLのＤＣＭで４回洗浄した。樹脂を３×３５０mLのＩＰＡで洗浄することにより脱膨潤させた。樹脂を一定重量まで乾燥させて、３８．２０gの添加樹脂を得た。分析は添加係数０．１８mmol/gを示した。]
[0168] Ｂ．固相合成
この実施例１のパートＡにおいて調製された、０．１８mmol/gで添加された２０．０gのＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−２−ＣＴＣ樹脂を用いて開始し、固相合成を行った。樹脂を、ＤＣＭ（２００mL）中で３０分間、２５℃で膨潤させた。ＤＣＭ溶媒を排出させて、樹脂を３回、ＮＭＰで洗浄した（各々の洗浄で５容積）。]
[0169] 樹脂を、次に、ＮＭＰ中の２０%容積のピペリジンで２回処理し（各々の処理で５容積）、Ｆｍｏｃ保護基を除去した。第２の２０%ピペリジン／ＮＭＰ処理後、樹脂をネガティブクロラニルテストへのＮＭＰで５回洗浄した（各々の洗浄で５容積）。]
[0170] 結合溶液を調製するために、アミノ酸（２．８５当量）及び６−クロロ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６−Ｃｌ−ＨＯＢＴ、２．８５当量）を秤量し、２．５５×容積のＮＭＰ中に溶解させて、次にＤＩＥＡ（３．２５当量）と５℃〜１０℃で合わせた。ＴＢＴＵ（２．８５当量）を１．３×容積のＮＭＰ中に５℃〜１０℃で溶解させた。２つの溶液を次に合わせた。結果として生じた溶液を反応容器に加えた。フラスコを、リアクター中に加えられた１．３×容積のＤＣＭでリンスして、それを次に２〜３時間、２５℃〜２７℃で撹拌した。サンプルをカイザーテストのために引いて、完了について反応をチェックした。結合反応が３時間後に未完了であった場合（ポジティブなカイザーテスト）、反応容器を排出させて、再結合を、活性化アミノ酸の新鮮溶液を用いて実施した。結合反応の完了後、結合溶液を排出させて、樹脂をＮＭＰで４回洗浄した（各々の洗浄で５容積）。次に、Ｆｍｏｃ保護基の除去及び結合反応サイクルを、フラグメント中の残りのアミノ酸について繰り返した（即ち、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）→Ａｉｂ→Ｈｉｓ（ｔｒｔ）の順番で）。]
[0171] 活性化Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（ｔｒｔ）−ＯＨとＨ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−２−ＣＴＣの間での結合反応の困難さ、及び、活性化Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（ｔｒｔ）−ＯＨの不安定さのため、結合反応は、１時間後に反応溶液を排出させて、そして直ぐに、第２の新鮮な活性化Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（ｔｒｔ）−ＯＨ溶液を用いて再結合反応を実施することにより強制的に完了させた。
この実施例のパートＢにおいて使用される全ての試薬を、以下の表に列挙する：]
[0172] ]
[0173] 樹脂結合ペプチドフラグメントを、ＮＭＰ（５容積）で４回、ＤＣＭ（６容積）で５回、ＩＰＡ（５容積）で３回、洗浄した。脱膨潤させた樹脂を、次に、３５℃で、真空下で乾燥させて、２２．５８gの樹脂及び樹脂結合ペプチドを得た。]
[0174] Ｃ．樹脂からのＦｍｏｃ及び側鎖保護フラグメントの切断。
上述の構築されたパートＢからの樹脂を、ＤＣＭ（使用された樹脂の重量と比べて１２．５容積；１２．５mlのＤＣＭ/樹脂のg又は１２．５リットル/kg）中で３０分間、２５℃で膨潤させて、そして次に、ＤＣＭで２回洗浄し（各々の洗浄で６．２５容積）、ＮＭＰ残基を除去した。樹脂を、最後のＤＣＭ洗浄液を用いて−５℃に冷却させた。ＤＣＭを排出させて、１% ＴＦＡ／ＤＣＭの冷溶液（１０容積、−５℃〜−１０℃）を加えて、３０分間、０℃で撹拌した。ピリジン（ＴＦＡの１．３当量）をリアクターに加えて、ＴＦＡを中和した。切断溶液をろ過除去して、フラスコ中に回収した。容器を２５℃まで温めながら、樹脂をＤＣＭで７回（７．５容積）洗浄した。洗浄液を切断溶液と合わせた。ＤＣＭ切断溶液を水（７．５容積）と合わせた。結果として生じた混合物を減圧下で蒸留して、ＤＣＭを除去した（３５０トール、２８℃）。ペプチドフラグメントが、ＤＣＭ除去時に水から析出した。フラグメントを水で洗浄し、そして３０℃〜３５℃で、真空下で乾燥させた。合計４．７３gのＦｍｏｃ−（Ａｉｂ８）ＧＬＰ−１（７−１０）−ＯＨが得られた。]
[0175] 実施例２
Ａ．Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−添加２ＣＴＣ樹脂の調製
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−添加２ＣＴＣ樹脂を調製した。使用された試薬の量を以下の表に列挙する：]
[0176] ]
[0177] ２−ＣＴＣ樹脂を５００mLペプチドリアクターに充填して、４００mLのＤＣＭを用いて３０分間、膨潤させた。床を排出させて、８容積のＤＭＦ：ＤＣＭ（８７．５：１２．５容積）中の溶液Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ及びＤＩＥＡを加えた。混合物を、窒素下で２時間、温度２５℃で撹拌した。]
[0178] 樹脂床を排出させて、４００mLのＤＭＦで１回そして２００mLのＤＭＦで１回洗浄した。次に、２−ＣＴＣ樹脂上の残りの活性部位を、３９０mLのＭｅＯＨ：ＤＩＥＡ（９：１容積）溶液で１時間エンドキャップした。床を再び排出させて、３５０mLのＤＭＦで２回洗浄し、そして３５０mLのＤＣＭで４回洗浄した。樹脂を次に３×３５０mLのＩＰＡで洗浄することにより脱膨潤させた。樹脂を、３５℃で、真空下で一定重量まで乾燥させて、４８．５１gの添加樹脂を得た。分析は添加係数０．５４mmol/gを示した。]
[0179] Ｂ．固相合成
０．５４mmol/gで添加された２７．５９gのＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−２−ＣＴＣ樹脂を用いて開始し、固相合成を行った。樹脂を、ＤＣＭ（３００mL）中で３０分間、２５℃で膨潤させた。ＤＣＭ溶媒を排出させて、樹脂をＮＭＰで３回洗浄した（各々の洗浄で５容積）。]
[0180] 樹脂を、次に、ＮＭＰ中の２０%容積のピペリジンで２回処理し（各々の処理で５容積）、Ｆｍｏｃ保護基を除去した。第２の２０%ピペリジン／ＮＭＰ処理後、樹脂をネガティブクロラニルテストへＮＭＰで６回洗浄した（各々の洗浄で５容積）。]
[0181] 結合溶液を調製するために、アミノ酸（１．７当量）及び６−クロロ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６−Ｃｌ−ＨＯＢＴ、１．７当量）を秤量し、４．６×容積のＮＭＰ中に溶解させて、次にＤＩＥＡ（１．９当量）と１０℃〜５℃で合わせた。ＴＢＴＵ（１．７当量）を２．２８×容積のＮＭＰ中に１０℃〜５℃で溶解させた。２つの溶液を次に合わせた。結果として生じた溶液を反応容器に加えた。フラスコを、２．２８×容積のＤＣＭでリアクター中へリンスして、それを次に２〜３時間、２５℃〜２７℃で撹拌した。サンプルをカイザーテストのために引いて、完了について反応をチェックした。結合反応の完了後、結合溶液を排出させて、樹脂をＮＭＰで４回洗浄した（各々の洗浄で５容積）。Ｆｍｏｃ保護基の除去及び結合反応サイクルを、フラグメント中の残りのアミノ酸について繰り返した（即ち、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）→Ａｉｂ→Ｈｉｓ（ｔｒｔ）の順番で）。]
[0182] この実施例において使用される全ての試薬を、以下の表に列挙する：]
[0183] ]
[0184] Ｃ．樹脂からのフラグメントの切断
構築された樹脂を、ＮＭＰ（５容積）で６回、そして次にＤＣＭ（６容積）で８回洗浄して、ＮＭＰ残基を除去した。樹脂を、最後のＤＣＭ洗浄液を用いて−５℃に冷却させた。ＤＣＭを排出させた後、１% ＴＦＡ／ＤＣＭの冷（−５℃〜−１０℃）溶液（１０容積）を加えて、結果として生じたポット混合物を３０分間、０℃で撹拌した。ピリジン（ＴＦＡの１．３当量）をリアクターに充填して、ＴＦＡを中和した。切断溶液をフラスコ中に回収した。容器を２５℃まで温めながら、樹脂をＤＣＭ（７．５容積）で１１回洗浄し、切断溶液中に排出させた。ＤＣＭ溶液を水（１０容積）と合わせた。結果として生じた混合物を減圧下で蒸留して、ＤＣＭを除去した（３５０トール、２８℃）。フラグメントが、ＤＣＭ除去時に水から析出した。フラグメントを水で洗浄し、そして３０℃〜３５℃で、真空下で乾燥させた。合計１１．１２gのＦｍｏｃ−（Ａｉｂ８）ＧＬＰ−１（７−１０）−ＯＨ（７８．８%収率）が得られた。]
[0185] 実施例３
Ａ．Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−添加２ＣＴＣ樹脂の調製
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−添加２ＣＴＣ樹脂を調製した。使用された試薬の量を以下の表に列挙する：]
[0186] ]
[0187] ２−ＣＴＣ樹脂を５００mLペプチドリアクターに充填して、４００mLのＤＣＭを用いて３０分間、膨潤させた。床を排出させて、８容積のＤＭＦ：ＤＣＭ（８７．５：１２．５容積）中の溶液Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ及びＤＩＥＡを加えた。混合物を、窒素下で２時間、温度２５℃で撹拌した。]
[0188] 床を排出させて、４００mLのＤＭＦで１回洗浄した。次に、２−ＣＴＣ樹脂上の残りの活性部位を、３９０mLのＭｅＯＨ：ＤＩＥＡ（９：１）溶液で１時間エンドキャップした。床を排出させて、３５０mLのＤＭＦで２回洗浄し、そして次に３５０mLのＤＣＭで４回洗浄した。樹脂を４×２５０mLのＩＰＡで洗浄することにより脱膨潤させた。樹脂を、３５℃で、真空下で一定重量まで乾燥させて、５２．０２gの添加樹脂を得た。分析は添加係数０．７２mmol/gを示した。]
[0189] Ｂ．固相合成
０．７２mmol/gで添加された２４．４３gのＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−２−ＣＴＣ樹脂を用いて開始し、固相合成を行った。樹脂を、ＤＣＭ（２５０mL）中で３０分間、２５℃で膨潤させた。ＤＣＭ溶媒を排出させて、樹脂をＮＭＰで３回洗浄した（各々の洗浄で５容積）。]
[0190] 樹脂を、次に、ＮＭＰ中の２０%ピペリジンで２回処理し（各々の処理で５容積）、Ｆｍｏｃ保護基を除去した。第２の２０%ピペリジン／ＮＭＰ処理後、樹脂をネガティブクロラニルテストへＮＭＰを用いて６回洗浄した（各々の洗浄で５容積）。]

权利要求:

請求項1
インシュリン分泌性ペプチドを作る方法であって、以下の工程：ａ）（配列番号５）式中、Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；Ｚは、Ｎ末端保護基であり；Ｂ’は、−ＯＨであり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメントを提供すること、ｂ）（配列番号６）式中、Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを提供するために、第１のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、ｃ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号６）式中、Ｚは、Ｈ−であり；Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを与えること、ｄ）（配列番号７）式中、Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；Ｚは、Ｎ末端保護基であり；Ｂ’は、−ＯＨであり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第４のペプチドフラグメントを提供すること、ｅ）（配列番号８）式中、Ｚは、Ｎ末端保護基であり；Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第５のペプチドフラグメントを提供するために、第４のペプチドフラグメントを第３のペプチドフラグメントに溶液中で結合させること、ｆ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号１４）式中、Ｚは、Ｈ−であり；Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第６のペプチドフラグメントを与えること、ｇ）（配列番号９）式中、Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；Ｚは、Ｎ末端保護基であり；Ｂ’は、−ＯＨであり；そしてＨ及びＥの各々は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第７のペプチドフラグメントを提供すること、及びｈ）第７のペプチドフラグメントを第６のペプチドフラグメントに溶液中で結合させて、（配列番号１０）式中、Ｚは、Ｎ末端保護基であり；Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含むのアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを提供すること、を含む方法。
請求項2
請求項１記載のインシュリン分泌性ペプチドを作る方法であって、以下の工程：ａ）（配列番号５）式中、Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；Ｂ’は、−ＯＨであり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメントを提供すること、ｂ）（配列番号６）式中、Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを提供するために、第１のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、ｃ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号６）式中、Ｚは、Ｈ−であり；Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを与えること、ｄ）（配列番号７）式中、Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；Ｂ’は、−ＯＨであり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第４のペプチドフラグメントを提供すること、ｅ）（配列番号８）式中、Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第５のペプチドフラグメントを提供するために、第４のペプチドフラグメントを第３のペプチドフラグメントに溶液中で結合させること、ｆ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号８）式中、Ｚは、Ｈ−であり；Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第６のペプチドフラグメントを与えること、ｇ）（配列番号９）式中、Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；Ｂ’は、−ＯＨであり；そしてＨ及びＥの各々は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第７のペプチドフラグメントを提供すること、及びｈ）第７のペプチドフラグメントを第６のペプチドフラグメントに溶液中で結合させて、（配列番号１０）式中、Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含むのアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを提供すること、を含む方法。
請求項3
請求項１又は請求項２記載の方法であって、以下の工程：ｉ）インシュリン分泌性ペプチドのＮ末端保護基を除去して、（配列番号１０）式中、Ｚは、Ｈ−であり；Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；Ｘ３５Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを与えること、及びｊ）工程ｉ）により得られるインシュリン分泌性ペプチドを酸と接触させ、アミノ酸側鎖を脱保護させて、（配列番号１１）式中、Ｚは、Ｈ−であり；そしてＸ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であるのアミノ酸配列を含む脱保護インシュリン分泌性ペプチドを与えること、をさらに含む方法。
請求項4
脱保護されたインシュリン分泌性ペプチドが、アミノ酸配列（配列番号１２）を有する、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
請求項5
インシュリン分泌性ペプチドを作る方法であって、以下の工程：ａ）（配列番号５）式中、Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；Ｚは、Ｎ末端保護基であり；Ｂ’は、固相樹脂であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメントを提供すること、ｂ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号５）式中、Ｚは、Ｈ−であり；Ｂ’は、固相樹脂であり；Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを与えること、ｃ）（配列番号７）式中、Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；Ｚは、Ｎ末端保護基であり；Ｂ’は、−ＯＨであり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを溶液中で提供すること、ｄ）（配列番号１３）式中、Ｚは、Ｎ末端保護基であり；Ｂ’は、固相樹脂であり；Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第４のペプチドフラグメントを提供するために、第３のペプチドフラグメントを溶液中で第２のペプチドフラグメントに結合させること、ｅ）（配列番号８）式中、Ｚは、Ｎ末端保護基であり；Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第５のペプチドフラグメントを提供するために、第４のペプチドフラグメントを固相樹脂から除去して、第４のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、ｆ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号８）式中、Ｚは、Ｈ−であり；Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第６のペプチドフラグメントを与えること、ｇ）（配列番号９）式中、Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；Ｂ’は、−ＯＨであり；そしてＨ及びＥの各々は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第７のペプチドフラグメントを提供すること、及びｈ）第７のペプチドフラグメントを第６のペプチドフラグメントに溶液中で結合させて、（配列番号１０）式中、Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含むのアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを提供すること、を含む方法。
請求項6
請求項５記載のインシュリン分泌性ペプチドを作る方法であって、以下の工程：ａ）（配列番号５）式中、Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；Ｂ’は、固相樹脂であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメントを提供すること、ｂ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号５）式中、Ｚは、Ｈ−であり；Ｂ’は、固相樹脂であり；Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを与えること、ｃ）（配列番号７）式中、Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；Ｂ’は、−ＯＨであり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを溶液中で提供すること、ｄ）（配列番号１３）式中、Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；Ｂ’は、固相樹脂であり；Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第４のペプチドフラグメントを提供するために、第３のペプチドフラグメントを溶液中で固相中で第２のペプチドフラグメントに結合させること、ｅ）（配列番号８）式中、Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第５のペプチドフラグメントを提供するために、第４のペプチドフラグメントを固相樹脂から除去して、第４のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、ｆ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号８）式中、Ｚは、Ｈ−であり；Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第６のペプチドフラグメントを与えること、ｇ）（配列番号９）式中、Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；Ｂ’は、−ＯＨであり；そしてＨ及びＥの各々は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第７のペプチドフラグメントを提供すること、及びｈ）第７のペプチドフラグメントを第６のペプチドフラグメントに溶液中で結合させて、（配列番号１０）式中、Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含むのアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを提供すること、を含む方法。
請求項7
請求項５又は請求項６記載の方法であって、以下の工程：ｉ）インシュリン分泌性ペプチドのＮ末端保護基を除去して、（配列番号１０）式中、Ｚは、Ｈ−であり；Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；Ｘ３５Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを与えること、及びｊ）工程ｉ）により得られるインシュリン分泌性ペプチドを酸と接触させ、アミノ酸側鎖を脱保護させて、（配列番号１１）式中、Ｚは、Ｈ−であり；及びＸ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であるのアミノ酸配列を含む脱保護インシュリン分泌性ペプチドを与えること、をさらに含む方法。
請求項8
脱保護されたインシュリン分泌性ペプチドが、アミノ酸配列（配列番号１２）を有する、請求項５〜７のいずれか一項記載の方法。
請求項9
インシュリン分泌性ペプチドを作る方法であって、以下の工程：ａ）（配列番号１３）式中、Ｚは、Ｎ末端保護基であり；Ｂ’は、−ＯＨであり；Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基が、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメント又はその対応物を提供すること、ｂ）（配列番号８）式中、Ｚは、Ｎ末端保護基であり；Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを提供するために、第１のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、ｃ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号８）式中、Ｚは、Ｈ−であり；Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを与えること、ｄ）（配列番号９）式中、Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；Ｚは、Ｎ末端保護基であり；Ｂ’は、−ＯＨであり；そしてＨ及びＥの各々は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第４のペプチドフラグメントを提供すること、及びｅ）第４のペプチドフラグメントを第３のペプチドフラグメントに溶液中で結合させて、（配列番号１０）式中、Ｚは、Ｎ末端保護基であり；Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含むのアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを提供すること、を含む方法。
請求項10
請求項９記載のインシュリン分泌性ペプチドを作る方法であって、以下の工程：ａ）（配列番号１３）式中、Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；Ｂ’は、−ＯＨであり；Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基が、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメント又はその対応物を提供すること、ｂ）（配列番号８）式中、Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを提供するために、第１のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、ｃ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号８）式中、Ｚは、Ｈ−であり；Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを与えること、ｄ）（配列番号９）式中、Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；Ｂ’は、−ＯＨであり；そしてＨ及びＥの各々は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第４のペプチドフラグメントを提供すること、及びｅ）第４のペプチドフラグメントを第３のペプチドフラグメントに溶液中で結合させて、（配列番号１０）式中、Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含むのアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを提供すること、を含む方法。
請求項11
請求項９又は請求項１０記載の方法であって、以下の工程：ｉ）インシュリン分泌性ペプチドのＮ末端保護基を除去して、（配列番号１０）式中、Ｚは、Ｈ−であり；Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；Ｘ３５Ｘ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを与えること、及びｊ）工程ｉ）により得られるインシュリン分泌性ペプチドを酸と接触させ、アミノ酸側鎖を脱保護させて、（配列番号１１）式中、Ｚは、Ｈ−であり；そしてＸ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であるのアミノ酸配列を含む脱保護インシュリン分泌性ペプチドを与えること、をさらに含む方法。
請求項12
脱保護されたインシュリン分泌性ペプチドが、アミノ酸配列（配列番号１２）を有する、請求項９〜１１のいずれか一項記載の方法。
請求項13
アミノ酸配列（配列番号１４）のペプチドであって、式中、Ｚは、Ｈ−及びＦｍｏｃ−から選択され；Ｂ’は、−ＯＨ又は固相樹脂であり；Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む、ペプチド。
請求項14
疑似プロリンのジペプチド残基が、疑似プロリンのＳｅｒ−Ｓｅｒ残基である、請求項１３記載のペプチド。
請求項15
アミノ酸配列（配列番号１５）のペプチドであって、式中、Ｚは、Ｈ−及びＦｍｏｃ−から選択され；Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む、ペプチド。
請求項16
疑似プロリンのジペプチド残基が、疑似プロリンのＳｅｒ−Ｓｅｒ残基である、請求項１５記載のペプチド。
請求項17
インシュリン分泌性ペプチドを作る方法であって、以下の工程：ａ）（配列番号１６）式中、Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；Ｚは、Ｎ末端保護基であり；Ｂ’は、固相樹脂であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第１のペプチドフラグメントを提供すること、ｂ）工程ａ）の第１のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第１のペプチドフラグメント（配列番号１６）式中、Ｂ’は、−ＯＨである；を溶液中で産生させること、ｃ）（配列番号１７）式中、Ｚは、Ｎ末端保護基であり；Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第２のペプチドフラグメントを提供するために、第１のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、ｄ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号１７）式中、Ｚは、Ｈ−であり；Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含むのアミノ酸配列を含む第３のペプチドフラグメントを与えること、を含む方法。
請求項18
インシュリン分泌性ペプチドを作る方法であって、以下の工程：ａ）（配列番号１８）式中、Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；Ｂ’は、固相樹脂であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含むペプチドフラグメントを提供すること、及びｂ）工程ａ）のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、ペプチドフラグメント（配列番号１８）式中、Ｂ’は、−ＯＨであるを溶液中で産生させること、を含む方法。
請求項19
請求項１７記載の方法であって、以下の工程：ｅ）（配列番号１８）式中、Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；Ｂ’は、固相樹脂であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む；のアミノ酸配列を含む第４のペプチドフラグメントを提供すること、及びｆ）工程ｅ）の第４のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第４のペプチドフラグメント（配列番号１８）式中、Ｂ’は、−ＯＨであるを溶液中で産生させること、をさらに含む方法。
請求項20
請求項１９記載の方法であって、以下の工程：ｇ）（配列番号１０）式中、Ｚは、Ｎ末端保護基であり；Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含むのアミノ酸配列を含む第５のペプチドフラグメントを提供するために、第４のペプチドフラグメントを第３のペプチドフラグメントに溶液中で結合させること、をさらに含む方法。
請求項21
請求項２０記載の方法であって、以下の工程：ｈ）Ｎ末端保護基を除去して、（配列番号１０）式中、Ｚは、Ｈ−であり；Ｘ８及びＸ１０は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；Ｘ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含むのアミノ酸配列を含む第６のペプチドフラグメントを与えること、をさらに含む方法。
請求項22
請求項２１記載の方法であって、以下の工程：ｉ）アミノ酸側鎖を脱保護させて、（配列番号１１）式中、Ｚは、Ｈ−であり；及びＸ８、Ｘ１０及びＸ３５は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であるのアミノ酸配列を含む脱保護インシュリン分泌性ペプチドを与えるために、工程ｈ）により得られるインシュリン分泌性ペプチドを酸と接触させること、をさらに含む方法。
請求項23
脱保護されたインシュリン分泌性ペプチドが、アミノ酸配列（配列番号１２）を有する、請求項１７〜２２のいずれか一項記載の方法。
請求項24
アミノ酸配列（配列番号１８）のペプチドであって、式中、Ｚは、Ｈ−及びＦｍｏｃ−から選択され；Ｂ’は、−ＯＨ又は固相樹脂であり；Ｘ１７−１８は、疑似プロリンのジペプチド残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む、ペプチド。
請求項25
疑似プロリンのジペプチド残基が、疑似プロリンのＳｅｒ−Ｓｅｒ残基である、請求項２４記載のペプチド。
請求項26
アミノ酸配列（配列番号１７）を有するペプチドであって、式中、Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；そしてＸ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む、ペプチド。
請求項27
Ｘ３５が、Ａｉｂである、請求項２６記載のペプチド。
請求項28
アミノ酸配列（配列番号１６）式中、Ｂ’は、固相樹脂又は−ＯＨであり；Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；そしてＸ３５は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり；そして前記配列の１つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む、を有するペプチド。
請求項29
Ｘ３５が、Ａｉｂである、請求項２８記載のペプチド。
請求項30
インシュリン分泌性ペプチドを作る方法及び本明細書において先に定義されたペプチド。